莫能菌素高产菌株的选育

李子勇，李云飞，曾晓宁，梁景乐,2

（1.山东胜利生物工程有限公司 山东济宁 272000；2.中牧实业股份有限公司 北京 100070）

莫能菌素（Monensin）亦称莫能霉素、肉桂霉素和瘤胃素莫能菌素，属五环多醚结构的酸性抗生素，它是由美国礼来公司（Eli Lilly）首先研制成功，在1967 年首先由Haney 等人从肉桂地链霉菌（Streptomyces cinnamonensis）的发酵液中分离得到，为聚醚类离子载体抗生素中应用最为广泛的药物之一[1]。

莫能菌素具有广谱的抗球虫活性，用于鸡球虫病防治和肉牛促生长。对革兰氏阴性菌无作用；但对葡萄球菌、杆菌、梭菌、链球菌、霉菌（青霉菌、念珠菌）有一定的抑制作用。莫能菌素主要作为饲料添加剂直接饲喂动物，根据近年学者研究报道，对反刍动物作用主要是抑制瘤胃内革兰氏阳性菌生长，提高瘤胃发酵产生的丙酸比例，抑制甲烷的产生，提高饲料能量的利用率，减少机体对蛋白质的浪费，从而促进动物生长，改善饲料转化率。莫能菌素还能抑制乳酸产生菌的活性，减少乳酸的数量，预防动物乳酸中毒[2]。肉桂地链霉菌作为莫能菌素的生产菌种，其生产能力直接影响着发酵水平，而且生产企业使用的菌种一般为人工选育的非自然高产菌株，其次遗传性能具有不稳定性，必须经常对其进行菌种选育，以保障生产性能。目前工业化生产的抗生素菌株主要通过诱变育种获得，李依韦等[3]利用紫外诱变与化学诱变得到产量提高16.65%的高产菌株。秦艳飞等[4]通过紫外-氯化锂诱变并结合氨基酸抗性筛选得到高产菌株产量提高72.5%。随着生物技术的发展成熟，基因工程技术也被应用于菌种选育，但由于其对技术和设备要求比较高，过程复杂，费用较大，且成功率较低，诱变育种仍是工业菌种选育最为有效的手段[5]。

本文在紫外-氯化锂双重诱变基础上[6]，结合琼脂块法筛选、摇瓶筛选诱变菌株，得到优质高产的肉桂地链霉菌菌株，经过冷冻保藏和传代验证后，生产能力保持稳定传递，运用到发酵车间大生产后，可大大提高发酵生产效率。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种原始菌种：MON17042，山东胜利生物工程有限公司生产用菌种。生物测定指示菌：枯草芽孢杆菌，山东胜利生物工程有限公司保藏菌种。

1.1.2 培养基平板和斜面培养基：淀粉2%、琼脂粉2.5%、硝酸钾0.1%、硫酸镁0.05%、硫酸亚铁0.1%、氯化钠0.05%、磷酸氢二钾0.05%。

种子瓶培养基：口服葡萄糖0.5%、糊精2%、黄豆饼粉1.5%、酵母粉0.25%。

发酵瓶培养基：黄豆饼粉3.5%、口服葡萄糖3.5%、豆油2.0%、硫酸铵0.2%、氯化锌0.03%、硫酸镁0.007%、硫酸亚铁0.005%、VC 0.0002%、磷酸氢二钾0.005%、碳酸钙0.25%。

1.1.3 试剂葡萄糖、酵母粉、淀粉、琼脂粉、碳酸钙、氯化钠、氯化锌、硫酸镁、磷酸氢二钾、硫酸铵、硫酸亚铁等均为国产分析纯。

1.1.4 仪器设备高效液相色谱仪，沃特世中国有限公司；SPH-322TD 型敞开式摇瓶机，上海世平实验设备有限公司；SCB-1520 型超净工作台，北京东联哈尔仪器制造有限公司；SPX-250B-2 型生化培养箱，上海博讯仪器有限公司；紫外线诱变箱，济南杰康净化设备厂；磁力搅拌器，南通麦格磁力机械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 单孢子悬液制备将原始菌液梯度稀释后涂布于分离培养基表面，33℃培养9～12d，挑取长势良好的菌落传斜面，作为出发菌株。向培养好的新鲜孢子斜面中加入10mL 的无菌水，用接种环将孢子刮下，振荡打碎20～30min，四层滤纸过滤，得单孢子悬液[7]。

1.2.2 菌种的紫外线-氯化锂复合诱变吸取MON17042 菌株的孢子悬液5mL 置于带磁力搅拌器的平皿中放在紫外灯下进行照射，准确计时，UV 诱变的条件是：紫外灯功率20W，照射距离20cm，照射时间50s，诱变后把孢子悬液均匀涂布在加有1.0%氯化锂的分离平板上，每个平板约滴入0.2mL 孢子悬液，共接分离平板20 支，33℃培养9～12d[8]。

1.2.3 琼脂块初筛待平皿刚刚长出针尖样菌落时，用打孔器连同下面的琼脂一起取出，转移至无菌空平皿，保持相同的湿度，33℃培养3d。把每一长满单菌落的琼脂块移至已混有指示菌的大块琼脂平板，33℃培养4d，分别测定各琼脂块的抑菌圈，并用原始菌株做对照。

1.2.4 摇瓶复筛挑选抑菌圈较大的单菌落传斜面培养，培养成熟后编号保存，并转接摇瓶进行复筛。摇瓶培养采用二级培养，挖取新鲜斜面（1cm× 1cm）接至装有25mL 种子培养基的250mL摇瓶中，转速200rpm，33℃培养20～26h 后，转至装有50mL 发酵培养基的500mL 发酵瓶中培养，接种量6%，8 层纱布用线绳扎紧，220rpm，33℃培养10d。

1.2.5 效价测定高效液相色谱—柱后衍生化—紫外检测法[9]分离测定发酵液效价：用甲醇—水提取发酵液中的莫能菌素，以甲醇—冰乙酸—水（体积比94:3:3）作为流动相，香草醛为衍生剂，流动相和衍生剂流速均控制0.7mL/min，反应温度95℃，采用C18的色谱柱，检测波长520nm，进样量20μL。

1.2.6 稳定性考察得到的高产突变株进行传代和4℃冰箱保存试验，以观察其传代稳定性和4℃冰箱保藏过程中生产能力的稳定性。本研究考察了突变株1～5 代在4℃冰箱斜面分别保藏30、60、90、120d 的摇瓶发酵产量水平，以观察其稳定性。

2 结果与分析

2.1 筛选结果

经诱变处理后，从分离平板中挑出26 个抑菌圈较大的菌株进行摇瓶培养，测定效价，得到3 株产量明显超过原始菌，且每株增长幅度均在35%以上。结果见表1。

表1 突变菌株与出发菌株对照

2.2 遗传稳定性考察结果

将3 支高产菌株在斜面培养基上连续进行0～4℃保存、传代，同等条件下摇瓶发酵后再测定其放瓶效价，结果见表2。

表2 突变菌株传代、冷藏后的摇瓶发酵表现（μg/mL）

从表2 可知高产突变菌株连续传代5 次，其发酵能力几乎没有下降，保持比较稳定。从第6 代开始有一定幅度的下降，但并不影响其总体发酵能力。菌种保藏时间比较试验显示，在0～4℃的温度条件下保藏菌种，4 个月后菌种代谢能力稍有下降，但总体变化不大。现阶段该莫能菌素发酵生产一般使用F2 斜面作为生产菌种接瓶进罐，每批进罐菌株的制作间隔原则上也不会超过三个月，所以新筛选菌种的稳定性完全可以满足生产的需求。

2.3 筛选菌株发酵大生产验证

用验证过的009#、082#和116#菌株各选一支F2 斜面接种子瓶，用于发酵车间125m3发酵罐生产，其平均发酵水平比车间正常生产水平提高了接近15%（见图1）。

图1 筛选菌株与车间正常使用菌株发酵生产能力比较（μg/mL）

从图1 可知，在发酵罐生产中，高产菌株与出发菌株的整个发酵过程前期产量趋势基本一致，中后期以后发酵能力比原始菌株的优势开始显现，平均放罐效价达到47684u/mL，比对照菌株的发酵效价提高了14.7%。经过试验证明了筛选菌株在发酵能力上稳定可靠，可以作为车间生产菌种使用。

3 结果与讨论

紫外诱变和化学诱变作为促进微生物基因突变的一种传统方法，至今仍是工业微生物育种的重要手段，对微生物发酵行业的发展突破起到了积极作用。有大量报道称抗生素抗性基因可能与抗生素结构基因和调控基因存在着一定的联系[10]，抗生素产生菌中的抗性基因与抗生素合成的结构基因紧密连锁，可发生共突变，即抗性突变总是伴随着产量突变[11]。

本试验以MON17042 为出发菌株，经紫外线—氯化锂双重复合诱变处理，经过琼脂块初筛和摇瓶复筛，获得3 支高产突变菌株，平均摇瓶效价较对照提高37.6%。对筛选的菌株进行遗传稳定性试验表明，所筛选的高产菌株遗传稳定性强，多次传代后仍能保持较高的代谢能力。用于发酵车间大生产后，其实际表现与摇瓶表现基本一致，证明生产能力稳定可靠，可应用于工业化生产。