犬源大肠杆菌分离鉴定及耐药性分析研究

刘杉杉，孙伟，郭盈盈，李加英，田维倩，冉钢

（1.铜仁职业技术学院 贵州铜仁 554300；2.民族中兽药分离纯化技术国家地方联合工程研究中心 贵州铜仁 554300）

健康动物机体肠道内存在的大肠杆菌，多数并不致病。作为动物肠道内的共栖菌，大肠杆菌还能够产生抑制致病性大肠杆菌生长的大肠杆菌素。近年来，随着各种抗生素的滥用，大肠杆菌的耐药性呈显著增加的趋势[1]，以往的很多特效药效果变差甚至无效。宠物感染大肠杆菌不仅能影响到治疗效果，而且携带耐药基因的大肠杆菌可能会感染人，影响人类健康和疾病治疗效果[2-4]。我国多省份都有关于宠物犬大肠杆菌耐药性严重情况的报道[5-7]。

铜仁市某养殖场从建立至现在已有数年，从未进行大肠杆菌耐药性试验分析。为了解该养殖场大肠杆菌耐药的具体情况，本研究将从该养殖场采集2 只健康犬肛门拭子，分离大肠杆菌，进行耐药性分析。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与培养基

头孢噻吩、四环素、环丙沙星、庆大霉素、萘啶酸和氧氟沙星药敏纸片由Oxoid 公司生产。

普通LB 琼脂和液体培养基、胰酪胨大豆肉汤培养基、麦康凯琼脂培养基均由青岛海博生物公司提供。

1.2 样品采集

采集养殖场2 只健康犬肛门拭子样品，置于装有0.85%无菌生理盐水的样品采集管中，常温保存备用。采集过程中要注意对样品做好标记，谨防样品污染。

1.3 大肠杆菌分离鉴定

将含有肛门拭子的样品采集管涡旋振荡混匀，静置后用接种环取上清液1～2 环进行涂片，室温下自然干燥，经火焰固定后，进行革兰氏染色，并在显微镜下观察细菌形态。

同时对采集的样品进行细菌培养，将其分别划线接种于麦康凯琼脂培养基和营养琼脂培养基，37℃培养24 h 后，观察菌落形态，挑取疑似菌落再次进行革兰氏染色鉴定。菌落继续做纯化增菌后，利用大肠杆菌16S rDNA 特异性引物（F:5'-GCGGACGGGTGAGTAATGT-3'和R:5'-TCATCCTCTCAGA CCAGCTA-3'，引物由上海生工生物工程有限责任公司合成）进行PCR 鉴定[8]。

1.4 药敏试验

采用K-B 药敏纸片法，对分离的犬大肠杆菌进行药物敏感性检测。最终判断结果，参考美国临床和实验室标准化协会（CLSI）标准[9]。

2 结果

2.1 大肠杆菌的分离鉴定

将两只犬肛门拭子样品进行革兰氏染色检查，结果均显示为革兰氏阴性菌，且为杆状，中等大小。接种营养琼脂培养基，长出半透明无色菌落，中等大小，边缘整齐。接种麦康凯琼脂培养基，长出红色菌落，且表面光滑，边缘整齐。

利用大肠杆菌16S rDNA 特异性引物检测扩增到阳性菌，经测序结果分析，成功分离到2 株犬源性大肠杆菌。

2.2 药敏试验

对分离的2 株犬源大肠杆菌分别进行药敏试验，并测定抑菌圈直径，结果见表1。结果表明不同犬只分离出来的大肠杆菌具有不同的耐药性，其中一只犬分离的大肠杆菌对头孢噻吩、四环素、环丙沙星和庆大霉素均耐药，而对萘啶酸和氧氟沙星敏感；而另一只犬分离的大肠杆菌则对四环素、环丙沙星和和氧氟沙星均耐药，对头孢噻吩中度敏感，对萘啶酸和庆大霉素敏感。

表1 分离的两株大肠杆菌抑菌圈直径（mm）

3 讨论与分析

多重耐药表型一般定义为同时对3 类及3 类以上的抗生素耐药[10]。本研究共选取了4 类抗菌药物，即喹诺酮类、β -内酰胺类、氨基糖苷类和四环素类。统计结果表明，其中一株大肠杆菌对喹诺酮类和四环素类抗菌药物具有耐药性，而另一株大肠杆菌则对以上4 类抗菌药物均出现不同程度的耐药，即该养殖场已出现大肠杆菌的多重耐药现象。

临床上治疗犬疫病时各类抗生素被广泛使用甚至滥用，导致大肠杆菌耐药菌株不断产生。研究表明，耐药菌株在犬体内极有可能会进一步传播给人，或者通过环境作为媒介，再传播给人，危害人类健康[11]。近年来，我国多地区均有较为严重的犬源大肠杆菌耐药情况。该养殖场并没有使用任何抗生素对犬只进行过疫病防治，但分离到的两株大肠杆菌依然显示了较强的耐药性，且有多重耐药。这些结果提示应该规范使用抗生素，以免造成更加严重的公共卫生问题。

临床上治疗小动物疾病，往往会选择β -内酰胺类、氨基糖苷类和喹诺酮类为主要抗菌药物。但本研究显示，其中一只犬分离的大肠杆菌对庆大霉素敏感，头孢噻吩亦抗菌效果欠佳，提示应引起兽医临床工作者的关注。

本研究仅是对两只犬进行检测就发现了抗生素的耐药性，那么该养殖场是否存在更加广泛的犬源性细菌耐药性？有必要进一步开展犬源细菌耐药性监测，并制订抗菌药物的使用规范。