任 鹏 姬 伟 曹海伟 邱 奇
(1.中国石油长庆油田分公司油气工艺研究院;2.中国石油长庆油田分公司第九采油厂)
微生物在油泥污染修复中发挥着关键作用,是生物修复的主力[1-2];某些特定的微生物可产生表面活性剂,可减小水溶液界面张力,使油相在水相中分散,增加烃类化合物在水中溶解度,从而使烃类污染物被快速运输到细胞内进行降解[3-4]。微生物所产生的表面活性剂有多种,如糖脂、脂肽、多糖-脂类复合物、磷脂、脂肪酸和中性脂[5-6],与化学合成的表面活性剂相比,生物表面活性剂具有低毒性,易生物降解和极端环境的高选择性等优良特性[7-8]。
本研究以菌株Da-6产生的表面活性剂(以下简称BH)为研究对象,分别与市售表面活性剂在临界胶束浓度(CMC)、乳化性能、排油能力和洗脱效果等方面进行对比实验,研究BH表面活性的影响因素,以期验证表面活性剂BH在提高微生物对石油降解能力的基础上,可以保持对环境的低毒性,从而为油泥生物处理起到增效作用。
实验菌株:从北部某油田某井场油泥中筛选出一株可以产生高效生物表面活性剂的菌株Da-6,经项目组前期鉴定为黄单胞菌属(Xanthomonassp.)。
油泥样品:取自北部油田某采油井场油泥处理站处理后油泥尾渣,含油率为8%~10%,实验用油泥含油率实测值为8.25%。
实验仪器:SF-TGL-16M冷冻离心机(上海菲恰尔分析仪器有限公司),GF254硅胶板100 mm×150 mm(烟台维启化工产品有限公司),JK99c表面张力仪(赛多利斯科学仪器有限公司),JT-OIL460红外分光光度计(天津市精拓仪器科技有限公司)。
LB培养基:胰蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,NaCl 10 g,去离子水1 000 mL,pH值7.0。
发酵培养基:原油3.0 g,NH4NO32.5 g,MgSO44.0 g,KH2PO44.0 g,NaCl 2.0 g,酵母膏0.5 g,K2HPO44.0 g,微量元素液5.0 g(ZnSO40.29 g,CaCl20.24 g,CuSO40.25 g,MgSO40.17 g),去离子水1 000 mL,pH值7.0。
以上培养基均121℃高压灭菌20 min。
表面活性剂:全面了解表面活性剂的种类、性质、类别等情况,选取几种表面活性剂,见表1。
表1 表面活性剂特性
1.2.1 发酵液制备
将斜面保藏的Da-6菌株活化,制成菌悬液后吸取0.1 L转接至0.9 L发酵培养基中,35℃、160 r/min恒温振荡48 h,形成发酵液。
1.2.2 表面活性剂BH的提取与定性分析
取1 L发酵液于冷冻离心机中以6 000 r/min离心20 min后去除菌体,取上清液,滴加6 mol/L HCl调节pH值至2.0,4℃静置过夜后,再以6 000 r/min离心20 min,静置后收集沉淀物,用1 mol/L的NaOH溶液调节其pH值至中性。用二氯甲烷萃取3次,合并有机相于40℃旋转蒸发,最后将产物在冷冻干燥机中进行干燥,即得表面活性剂粗品。
用3 mL二氯甲烷将表面活性剂粗品溶解,点样于硅胶板进行TLC分析,再用氯仿、甲醇、水体积比为13∶5∶4的溶液展开,滴加不同显色剂,观察显色结果。结果表明,溶液遇0.5%茚三酮显色剂显红紫色,说明该表面活性剂为脂肽类表面活性剂。
1.2.3 表面活性剂性能研究
1)临界胶束浓度(CMC):将表面活性剂BH、鼠李糖脂、吐温80和SDS分别配制成0,15,25,35,45,55,65 mg/L浓度,用1 mol/L的NaOH溶液调节pH值为7.0,完全溶解后测定其表面张力,以表面活性剂溶液浓度为横坐标,以表面张力值为纵坐标,作出临界胶束浓度(CMC)曲线。出现拐点所对应的横坐标即为表面活性剂的CMC。
2)乳化实验[9]:分别取5 mL浓度为100 mg/L的BH、鼠李糖脂、吐温80和SDS于试管中,同时分别加入等体积的原油,充分振荡、静置。分别测定其不同时间(0,12,24,36,48,60,72 h)的乳化层高度,根据公式(1)计算乳化指数。
E=H乳/H总×100%
(1)
式中:E为乳化指数,%;H乳为乳化层的高度,cm;H总为液体总高度,cm。
3)排油能力实验[10]:分别配制不同浓度的BH、鼠李糖脂、吐温80和SDS(0,25,50,75,100,125,150,175,200 mg/L)表面活性剂溶液,取直径为90 mm的培养皿,在其中加入10 mL去离子水,之后在培养皿中央滴加200 μL原油,待原油以圆的形式扩散至铺满水面的油膜后,加1滴表面活性剂溶液到油膜的中心,油膜以圆圈的形式向四周扩散,测量不同浓度的表面活性剂溶液的排油圈直径,圆圈直径越大说明表面活性剂排油能力越强,即活性越高[11]。
4)洗脱实验:分别取20 mL的BH、鼠李糖脂、吐温80和SDS溶液(浓度为临界胶束浓度)于100 mL的锥形瓶中,向锥形瓶中分别加入5 g灭菌的油泥样品,每2 h取一次样,采用石油醚萃取-红外分光光度法测定锥形瓶中石油含量,计算各表面活性剂对油泥的洗脱率。
1.2.4 不同因素对BH表面活性的影响
配制浓度为25 mg/L的BH溶液,将溶液分别置于不同温度(10,20,40,60,80,100,120℃)条件下处理2 h,冷却至室温后测其表面张力。
在浓度为25 mg/L的BH溶液中加入NaCl,使其浓度分别为0%,4%,8%,12%,16%,20%,24%,28%,并测其表面张力。
用1 mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液将25 mg/L的BH溶液分别调节成不同pH值(2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13),并测其表面张力。
依次在硅胶板上滴加不同显色剂后,显色反应见图1。
图1 BH薄层层析显色反应
如图1所示,在硅胶板上(数字1处)滴加苯酚-硫酸和溴百里香酚蓝-氢氧化钠后,无颜色反应,滴加0.5%茚三酮后,出现一个红紫色斑点(数字2处),故初步判定所产生的表面活性剂是脂肽类物质。
2.2.1 CMC测定
陈露等[12]研究表明表面活性剂可使蒸馏水表面张力值降低。本研究将BH、鼠李糖脂、吐温80和SDS稀释成不同浓度后测定其表面张力,结果见图2。
图2 表面张力测定结果
由图2可知,当BH浓度增加到25 mg/L时,表面张力值最低,达到饱和值,因此可确定BH的CMC为25 mg/L,其表面张力稳定在25.98 mN/m。鼠李糖脂的浓度为35 mg/L时,表面张力最低达到饱和值,为30.19 mN/m。在实验浓度范围内,吐温80和SDS的表面张力曲线一直处于下降趋势,并未出现“拐点”,说明吐温80和SDS的CMC大于65 mg/L。由此可知,BH在达到CMC所需表面活性剂浓度方面要远远优于化学表面活性剂吐温80和SDS,略优于生物表面活性剂鼠李糖脂。
2.2.2 乳化性能测定
各表面活性剂在不同时间内(0,12,24,36,48,60,72 h)乳化指数变化见图3。
图3 表面活性剂乳化实验测定结果
由图3可知,乳化指数随着时间增加而逐渐减小,并在某个时间处于平稳状态。BH在24 h时,乳化指数明显下降至71.93%,72 h内乳化指数一直保持在70%左右,乳化比较稳定,乳化性能较好。鼠李糖脂在24 h时,乳化指数下降至69.64%,之后乳化指数保持在66%左右,而吐温80、SDS随着时间的增加,乳化指数分别保持在50%,46%左右。表明BH与其他3种表面活性剂相比,乳化稳定性高,乳化性能好。
2.2.3 排油性能测定
各表面活性剂所产生排油圈的直径见图4。
图4 表面活性剂排油圈直径对比
据文献[4]表明,表面活性剂排油性能可以用排油圈直径大小来反映。由图4可知,在不同浓度下,BH、鼠李糖脂、吐温80和SDS排油圈直径随着浓度的增大而增大。在相同浓度下,4种表面活性剂的排油圈直径大小为:BH>鼠李糖脂>吐温80>SDS。如在浓度均为200 mg/L时,BH排油圈直径为81.0 mm,鼠李糖脂为72.7 mm,吐温80为64.3 mm,SDS为58.3 mm,说明菌株Da-6产生的表面活性剂BH具有良好的排油性能。
2.2.4 油泥增溶实验结果
表面活性剂能够使附着在油泥颗粒中的石油烃洗脱下来供微生物利用和转化,间接提高微生物利用石油烃的效率,增强微生物降解石油能力。因此对4种表面活性剂BH、鼠李糖脂、吐温80和SDS进行增溶对比实验,其结果见图5。
图5 表面活性剂对原油增溶效果比较
由图5可知,洗脱率随着时间的增加不断增大,基本在12 h达到稳定,洗脱结束。4种表面活性剂洗脱效果比较:BH>鼠李糖脂>吐温80>SDS。BH的增溶率在12 h达到最大洗脱率90.23%,而鼠李糖脂的洗脱率在12 h最大为86.42%,吐温80的洗脱率在10 h达到最大,为75.80%,SDS在12 h为最大,洗脱率为72.84%,说明菌株Da-6自身产生的表面活性剂BH的增效作用明显优于其他3种表面活性剂,并且和化学表面活性剂相比,具有对环境无毒无污染的优点,与文献[13]得到的结果相同。这为BH用于后期油泥处理奠定了理论基础。
2.2.5 不同因素对BH表面活性的影响
根据不同温度、NaCl浓度及pH值对BH表面活性的影响,评价BH的稳定性。结果见图6、图7、图8。
图6 温度对BH表面活性的影响
图7 NaCl浓度对BH表面活性的影响
图8 pH值对BH表面活性的影响
由图6可知,温度在10~80℃范围内对BH的表面活性影响不大,BH在不同温度处理2 h后,其表面张力一直保持在26 mN/m左右;当温度过高,BH表面张力上升。说明BH在10~80℃时具有良好的稳定性,这为BH在低温及高温条件下的应用提供了一定的理论依据。
由图7可知,当NaCl浓度为0~16%时,BH的表面张力没有明显变化,保持在26 mN/m左右;当NaCl浓度高于16%,BH的表面活性受到限制,此时BH表面张力迅速上升。说明BH在NaCl浓度0~16%范围内具有良好的耐盐性。
由图8可知,当4 1)本实验从菌株Da-6发酵液中提取生物表面活性剂粗品BH,经TLC分析为脂肽类表面活性剂。 2)对BH性能进行研究,CMC为25 mg/L;在72 h内其乳化值保持在70%以上,乳化性能比较稳定;排油圈直径最大为81.0 mm;12 h内达到最大洗脱率90.23%。经对比研究,BH性能优于鼠李糖脂、吐温80和SDS。 3)BH在温度10~80℃,NaCl浓度0~16%,pH值4~13,可以保持较高的表面活性,表面张力保持在26 mN/m左右,具有良好的稳定性。3 结 论