民猪和大白猪背最长肌中肌红蛋白基因的表达量差异

李忠秋，刘春龙，吴赛辉，张冬杰，孙金艳，彭福刚，何鑫淼，马 红，刘 娣*

（1.黑龙江省农业科学院畜牧研究所，农业农村部种养结合重点实验室，黑龙江哈尔滨 150086；2.中国科学院东北地理与农业生态研究所，黑土生态重点实验室，黑龙江哈尔滨 150081）

猪肉颜色是消费者判断肉品品质最直接最简单的方法，也是影响消费者购买意愿的直接因素，颜色鲜红的猪肉一般被消费者认为品质较好[1-2]。肉色的主要呈色物质是肌肉中的肌红蛋白（Myoglobin）、血红蛋白（Hemoglobin）和细胞色素C3（Cytochrome C3）3 种物质。血红蛋白在猪只屠宰放血的过程中大量流失，对于肉色的贡献视放血程度和肌肉部位不同而定，占6%～16%[3]；细胞色素C3 对肉色的贡献率较小[4]；而肌红蛋白对充分放血的肉色的贡献率为80%～90%，肌红蛋白对肉色起决定作用[3,5-6]。

民猪是我国东北地区一个古老的地方猪种，具有繁殖性能高、抗寒抗病能力强、体质强健和肉品质好等优点。民猪的肉色鲜红、大理石花纹均匀、肌内脂肪含量高、口感细腻多汁、肉味香醇和无PSE 肉发生等[7-10]。研究表明民猪肉色评分显著高于大白猪[7]，而民猪与大白猪肌红蛋白基因表达差异报道较少。本实验在采用Lab 法测定民猪和大白猪肉色差异的基础上，采用Realtime-PCR 法研究民猪和大白猪背最长肌中肌红蛋白基因mRΝA 表达差异，从分子水平分析民猪和大白猪肉色差异的内在机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 在黑龙江省农业科学院畜牧研究所民猪养殖基地选取民猪（体重95kg）、民猪（160 d）和大白猪（体重95 kg，160 d）各6 头，共计18 头。试验日粮配方参照《瘦肉型猪饲养标准》（GB 8471-87）猪的营养需要配制而成。屠宰前，禁食24 h，不禁水，严禁鞭打、急赶、过度拥挤等刺激。屠宰后迅速取第13和14 肋间背最长肌肌肉样品1 g 左右，放入冻存管中，投入液氮，带回实验室，-80℃保存，用于检测肌红蛋白基因表达。取背最长肌于4℃冷库内排酸24 h，取胸腰椎连接部背最长肌鲜肉样进行肉色检测。

1.2 实验方法

1.2.1 肉色测定 测定胸腰椎连接部背最长肌。将色差计设置为D65 光源，波长400～700 nm。取排酸24 h 的胸腰椎连接部背最长肌，垂直肌肉走向取1 cm 厚肉片，用保鲜膜覆盖肉片新鲜切面，放入4℃冰箱，氧合30 min，取下保鲜膜，用仪器选择肉色均匀部分测量10 次，然后计算平均值。肉色指标包括亮度（L*）、红度（a*）、黄度（b*）。

1.2.2 总RΝA 的提取和cDΝA 合成按照Tri Pure RΝA Ιsolation Reagent 试剂盒说明提取肌肉样品的总RΝA，提取总RΝA 完整性的鉴定方法为琼脂糖凝胶电泳，总RΝA 浓度的测定方法为分光光度计测定OD值，通过公式计算并调整总RΝA 浓度为1 µg/µL，储存于-80℃冰箱待用。

cDΝA 合成严格按照Easy-Script One-Step g DΝA Removal and cDΝA Synthesis Snper Mix 试剂盒的要求进行。20 µL 反应体系：6 µL RΝA，1 µL Oligo dT Primer，4 µL Random Primer，4 µL 5×PrimeScript Buffer，1 µL PrimeScript RT Enzyme Mix Ι，4 µL Rnase free H2O。反应步骤为37℃ 15 min，85℃ 5 s，-20℃保存备用。

1.2.3 引物的设计和合成 根据ΝCBΙ 上提交的猪肌红蛋白序列设计荧光定量引物，以GAPDH为内参，引物序列及扩增片段长度见表1。

表1 肌红蛋白和GAPDH 的引物序列

1.2.4 荧光定量PCR 检测 荧光定量PCR 反应体系：2×Ultra SYBR Mixture 10 µL，0.2µmol/L 的 上、下 游引物各0.5 µL，cDΝA 产物0.5 µL，去离子水8.5 µL，总体积20 µL。荧光定量反应在Roche Light Cylcer480 ΙΙ 仪器上进行，反应程序：95℃ 10 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40 个循环；每个样品3 个重复。以GAPDH基因进行校正，目的基因的相对表达量采用2-ΔΔCt方法来计算。

1.2.5 统计分析 实验中计算获得的数据利用SPSS 13.0统计软件进行分析，数据用平均值±标准误表示，用单因素方差分析进行差异显著性分析，当P＜0.05 有统计学意义。

2 结果

2.1 同体重和同日龄民猪与大白猪的肉色分析 由表2 可见，同体重、同日龄民猪肉色a*值均高于大白猪（P＜0.05），b*值和L*值与大白猪差异不显著。

表2 同体重民猪和大白猪的肉色分析

2.2 同体重和同日龄民猪与大白猪肌红蛋白基因表达差异 由图1 和图2 可见，同体重、同日龄民猪肌红蛋白基因相对表达量均高于大白猪（P＜0.05）。

图1 同体重民猪和大白猪肌红蛋白基因表达情况

图2 同日龄民猪和大白猪肌红蛋白基因表达情况

3 讨论

肉色是评价猪肉品质的一个重要的经济指标，它直接影响消费者对猪肉的购买意愿和行为。大多数消费者认为鲜红的肉色是猪肉新鲜程度的表现，肉色若有变化则认为猪肉品质较差或已经腐败变质，消费者就不会有购买的欲望，经营者就会打折销售或丢弃。据统计，美国因为肉类变色问题每年造成的经济损失超过10 亿美元[11]。Lab 系统是测定和表示肉色比较客观和准确的方法，a*值表示红色度，是体现肉色的一个重要的指标。肉色评分与肉色a*值显著正相关，民猪肉色评分显著高于比大白猪[7]，本实验结果显示民猪肉色a*值显著高于大白猪，从另一方面表明民猪肉色好于大白猪。肌红蛋白是猪肉呈色的物质基础，其含量直接影响肉色的深浅[12]。肌红蛋白是脊椎动物肌肉中的血红素蛋白，主要以高浓度存在于骨骼肌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞的胞浆中，通过对不同品种猪背最长肌肌红蛋白含量和遗传参数研究发现，肌红蛋白含量为中等遗传力，遗传力估计值为0.27[13]。肌红蛋白含量是新鲜猪肉颜色的决定因素[14]，肌红蛋白基因表达调控主要在转录水平，mRΝA 表达量与肌红蛋白浓度呈显著正相关[15]，肉色a*值与肌红蛋白mRΝA 表达量显著相关[16-18]。本实验首次研究了民猪与大白猪背最长肌中肌红蛋白基因mRΝA 表达差异，从分子水平分析民猪与大白猪肉色差异的内在机制，结果显示民猪背最长肌肌红蛋白基因mRΝA 表达量均显著高于大白猪，进一步在分子水平上显示民猪肉色好于大白猪。民猪与大白猪的肌红蛋白含量表达的差异是否与两个品种某些部位的核苷酸序列的差异有关，尚需进一步研究。

4 结论

本实验结果显示，肌红蛋白含量对肉色有显著影响，民猪肌红蛋白表达量显著高于长白猪，这是民猪的肉色好于长白猪的内在原因。