溶菌酶的修饰及其在动物生产中的应用研究进展

张 琳，尚校兰，李秋玲，齐 颖，刘延国

（1.廊坊师范学院，河北省动物多样性重点实验室，河北廊坊 065000；2.廊坊师范学院，廊坊市食品营养与安全重点实验室，河北廊坊 065000；3.北京安佰特科技发展有限公司，北京 102600）

近年来，抗生素滥用问题引起了全社会的关注，抗生素在畜牧业中的应用也受到了诸多限制。2016 年7 月26 日，我国农业部（现为农业农村部，下同）发布2428号文件，要求2017 年5 月1 日停止使用硫酸粘杆菌素饲料添加剂预混剂。2018 年1 月11 日，农业农村部发布第2638 号公告，要求停止在食品动物中使用喹乙醇、氨苯胂酸、洛克沙胂等3 种兽药，以保障动物产品质量安全，维护公共卫生安全和生态安全。2019 年7 月9 日，农业农村部发布第194 号公告，要求2020 年1 月1 日起将退出除中药外的所有促生长类药物饲料添加剂品种。饲料端全面禁抗、养殖端减抗限抗已成大势所趋。在此背景下，寻找替代抗生素的新型绿色添加剂成为动物营养领域的研究热点。溶菌酶（Lysozyme，LZ）是一种有效的抗菌酶，于1921 年由苏格兰生物学家亚历山大·弗莱明发现[1]，此后便涌现出大量关于溶菌酶的基础科学研究。溶菌酶是动物机体中的非特异性免疫因子，能够直接作用于革兰氏阳性菌（G+）细胞壁，在渗透压作用下使微生物细胞胀裂死亡。革兰氏阴性菌（G-）的细胞壁黏肽层外有一层脂多糖和脂蛋白，对天然溶菌酶具有抗性，故天然溶菌酶对G-几乎无抑菌作用。近年来国内外学者不断尝试通过化学、物理、生物改性等方法对溶菌酶进行修饰，拓宽其抑菌谱，提高杀菌能力。溶菌酶与抗生素杀菌机制不同，不易产生耐药性，具有安全、无残留、活性稳定等优良抗菌特性，已逐渐应用于畜禽饲料中。本文就溶菌酶的修饰技术以及在动物生产中的应用进行综述，旨在为溶菌酶的开发和利用提供理论参考和依据。

1 溶菌酶的性质和来源

溶菌酶是一种糖苷水解酶，纯品为白色或白色晶体，热稳定性强，在干燥条件下可长期保存，其能够特异性水解Ν-乙酰葡萄糖胺和Ν-乙酰胞壁酸间的β-1，4 糖苷键位点，进而使细胞破裂。近年来研究显示，溶菌酶在无抗生素的畜禽饲粮中使用能够达到与抗生素饲粮同样的促生长效果[2-3]。Lee 等[4]研究表明，饲粮中添加外源溶菌酶能够提高畜禽生长性能和免疫力，改善肠道形态及肠道微生物区系结构。虽然溶菌酶抑菌效果明显，但其抗菌谱窄，使用空间受限，为了使其能够更广泛地应用于动物生产中，国内外学者对溶菌酶修饰做了大量研究。

2 溶菌酶的修饰方法

2.1 化学修饰 目前，溶菌酶化学修饰方法主要是利用脂肪酸、酚酸（醛）等小分子或者多糖及其他分子化合物对溶菌酶分子表面进行修饰，使疏水性有机小分子与溶菌酶的赖氨酸残基（氨基）共价结合后起到疏水性载体的功能，将溶菌酶送至质膜层。Liu 等[5]研究表明，中短链饱和脂肪酸C6:0 己酸、C10:0 葵酸、C14:0 肉豆蔻酸与溶菌酶结合能显著提高溶菌酶对大肠杆菌（E.coli）K-12 的抗菌活性，并且酶活力损失不大。自身具有抑菌活性的酚酸（醛）类有机小分子也常被用作溶菌酶的共价修饰。Valenta 等[6]研究发现，以E.coli和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus,S.aureus）为受试菌株，将肉桂醛与溶菌酶以1:3 的比例进行偶联，偶联物抑菌活性明显提高。多糖分子还原末端的醛基可与蛋白质分子中氨基酸侧链的自由氨基发生美拉德反应，生成蛋白质-多糖共价化合物，蛋白质的凝胶性、起泡性、溶解性、乳化性等功能特性得以增强，溶菌酶的赖氨酸末端氨基是其与多糖交联的结合位点[7]。Hashemi 等[8]研究表明，黄原胶（Xanthan Gum，XG）与溶菌酶通过美拉德反应得到的交联物Lyz-XG 能够显著抑制S.aureus与E.coli生长。乙二胺四乙酸（EDTA）、乳铁蛋白、乳酸等可作为细胞膜干扰剂，与细胞表面的脂多糖之间盐桥二价阳离子螯合，使细菌的细胞膜失去稳定性，从而调节部分细菌对溶菌酶的耐受性[9]。李小曼等[10]研究发现，乙二胺四乙酸二钠可协同溶菌酶作用于牙髓卟啉单胞菌，可使其抑菌作用提高约1.3～3.5 倍。

2.2 物理改性 相对于化学修饰，物理改性是利用机械能以热、压力等方法，通过蛋白质变性改变分子结构，从而提高溶菌酶的抑菌活性。研究发现，对溶菌酶加热有利于氨基酸的疏水性位点暴露，从而增加热处理衍生物（Heat-Denatured Lysozyme Derivative，HDLZ）低聚体的表面疏水性，提高溶菌酶与G-细胞膜的结合能力。Ιbrahim 等[11]研究显示，溶菌酶的杀菌机制与抗菌肽类似，均是通过破坏细胞膜的方式杀死微生物细胞。武瑶等[12]研究表明，对海参溶菌酶的C-端多肽（SjLys-C）进行热处理（100℃、40 min），其酶活及抑菌能力有所提高，分子动力学（MD）模拟表明，在热处理的过程中，SjLys-C 多肽的氨基酸残基随温度的变化发生内部结构重排，导致活性位点暴露，蛋白的抑菌活性改变，提示这可能是引起酶活增强的重要原因之一。高压技术是一种非热食品加工技术，高压处理不仅可以改变蛋白质分子结构，还可以改变其功能特性。Lucci 等[13]研究超高压协同溶菌酶对单增李斯特菌存活率的影响，结果表明，100 MPa 协同224 U/mL 溶菌酶较单独使用超高压处理脱脂牛奶，使单增李斯特菌的数目显著下降。高压处理对溶菌酶的抑菌活性的调节机制可能是：高压与溶菌酶之间的相互作用关联蛋白的构象改变。溶菌酶经高压处理后对植物乳杆菌具有抑制作用，但溶菌酶本身无此效果，这进一步证明了高压使溶菌酶活性中心结构改变[14]。高压处理对溶菌酶的抑菌活性调节机制可能是对细胞壁或外膜的直接破坏作用或高压技术使蛋白质空间结构发生变化，疏水区暴露，使蛋白不易发生凝聚，与细胞膜结合作用增强[15]。

2.3 生物改性 生物改性也是一种提升溶菌酶抑菌活性的方法，通过生物技术手段改变溶菌酶的结构，进而影响其功能及理化性质。比如可将抗菌肽或疏水基团引入溶菌酶分子结构中，增强自身疏水性，得以穿过脂多糖层进入G-的肽聚糖层，提高对G-的抑菌性能。Zhu 等[16]研究发现，将氨基酸序列为（A-W-V-A-W-K）的抗菌肽（SP）与猪溶菌酶（Sus scrofa lysozyme，SSL）的编码序列Ν端或C 端进行融合（图1），结果显示，构建表达载体后发酵产物SP-SSL 既能保留猪溶菌酶杀灭G+的能力，又具备抗菌肽的抗G-活性。通过Qrt-PCR、FC 等技术手段发现SP-SSL 可以使靶细胞E.coliATCC10798 的细胞壁结构发生破坏，靶细胞透性增强，从而使细胞内容物流出，导致细胞死亡。

在溶菌酶蛋白质结构中加入1 个外露的疏水性结构域[16]，如图2 所示，该结构可以与外膜发生融合，溶菌酶可插入质膜中进行杀菌[17]。有研究显示，在溶菌酶羧基端可插入疏水性肽，改性后溶菌酶酶活性变化不大，但对E.coli的杀菌能力显著增强，可能是由于溶菌酶对E.coli外膜和肽聚糖作用的结果[18-19]。

图2 提高溶菌酶杀灭革兰氏阴性菌能力的改造策略[16]

溶菌酶具有独特的生物学功能及药理作用，杀菌能力强，且不易产生耐药菌株，虽然其抗菌谱窄，但通过化学、物理及生物改性等方法均可以提高溶菌酶对G-的杀菌能力，拓宽抑菌谱，可为畜牧业提供更多有价值的新产品，有着重要的现实意义。

3 溶菌酶在动物生产中应用

溶菌酶具有抑菌、抗炎、抗氧化、抗病毒及提高机体免疫力等作用，其可作为饲料添加剂应用于动物生产中，可改善动物肠道菌群结构，提高生产性能。

3.1 在反刍动物生产中的应用 章伟建[20]从患有子宫内膜炎奶牛的子宫粘液中筛选链球菌30 株、金黄色葡萄球菌37 株，体外用溶菌酶与氨苄西林进行药敏试验，结果显示，溶菌酶对金黄色葡萄球菌与链球菌具有较好的抗菌活性，效果与氨苄西林杀菌效果相当，但氨苄西林会产生大量的耐药菌株。金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的主要致病菌之一，Maga 等[21]将人胎盘组织中克隆获得的人溶菌酶基因和人工合成的抗菌肽tachyplesins 链接，形成融合基因，在毕赤酵母中诱导表达，其产物对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、白色念珠菌等有一定的抑菌作用。欧阳萍[22]选用临床型奶牛乳房炎典型致病菌金黄色葡萄球菌建立小鼠实验性乳房炎感染模型并对其进行治疗，结果表明，融合蛋白显著抑制小鼠乳腺内金黄色葡萄球菌的增殖，对小鼠乳腺炎有一定的治疗作用，使抗肿瘤因子TΝF-α水平显著下调，减轻乳腺炎症。

3.2 在猪生产中的应用 肠道环境与动物健康息息相关，肠道微生物菌群是机体最复杂、最庞大的微生态系统，在营养及能量代谢、免疫系统、屏障保护、应激调节等方面有重要影响。Maga 等[23]将溶菌酶添加于仔猪饲料中，可显著增加仔猪粪便中乳酸杆菌和双歧杆菌的数量，有利于肠道健康。Oliver[24]等与Cooper[25]等也得出类似结论，证明溶菌酶可以提高断奶仔猪肠道的绒毛高度，降低隐窝深度，提高肠道绒隐比，溶菌酶对肠道形态的改善作用可能是由于肠道微生物区系变化所致。Oliver 等[26]将一种纯化的颗粒溶菌酶与抗生素对10 日龄仔猪的生长性能、小肠形态和弯曲杆菌的作用进行对比，结果显示，与空白组相比，饲粮中添加溶菌酶或抗生素均可提高小肠绒毛高度，处理组间小肠总黏膜和黏膜的蛋白浓度以及多糖酶活性没有显著差异，提示溶菌酶与抗生素的使用效果相当。

3.3 在家禽生产中的应用 张世卿等[27]研究添加溶菌酶可降低肉仔鸡的采食量、耗料增重比，提高日增重以及免疫相关指标，提示饲料中添加适量溶菌酶后，肉仔鸡能量、养分表观代谢率和免疫指标均有提高的趋势。孙小青[28]在肉鸭日粮中分别添加溶菌酶与3 种抗生素（那西肽、吉他霉素、金霉素），结果显示，对于提高肉鸭的日增重、免疫器官指数和降低日耗料量，溶菌酶的作用效果优于那西肽、吉他霉素、金霉素；溶菌酶对肉鸭盲肠中E.coli的抑制作用也优于3 种抗生素。王军等[29]研究一种家禽专用溶菌酶对AA 肉仔鸡生长性能和免疫器官发育情况的影响时也发现，溶菌酶可降低肉鸡的全期耗料增重比，提高法氏囊指数。汪海[30]通过重组人溶菌酶转基因模型研究发现，重组人溶菌酶对鸡肠道菌群具有一定的调节作用，可以促进肠道双歧杆菌的增长及出生后增重。另外重组人溶菌酶可通过改善鸡肠道炎性损伤并提前诱发体液免疫，增强鸡自身对沙门氏菌病的抑制作用。综上所述，溶菌酶可以提高动物机体免疫力，提高机体抵抗内外源有害微生物的能力，有效降低致病率和死亡率给养殖业带来的损失。

4 结语

溶菌酶在生物体内广泛存在，其可作为动物保健品及饲料添加剂应用于动物生产中，表现出较好的饲料报酬与生产性能。由于溶菌酶与抗生素抗菌机制不同，在抑杀病原体的同时不易产生抗药性，因此是替代抗生素的重要产品。同时，随着基础研究的不断充实，未来可以使用基因工程技术手段，构建动物源溶菌酶的表达系统，继续提高重组动物源溶菌酶的活性及表达量，促进溶菌酶产品广泛应用于医药业、食品加工业及畜牧业。