Sirt2 在哺乳动物卵母细胞成熟过程的调节作用与机制研究

李 飒，房晓欢，张效生，李俊杰,3*，孙树春,3*

（1.河北农业大学动物科技学院，河北保定 071000；2.天津市畜牧兽医研究所，天津 300381；3.河北省牛羊胚胎技术创新中心，河北保定 071000）

随着动物胚胎生物技术的快速发展，对于高质量卵母细胞的需求日益增加。卵母细胞体外成熟技术成为获得成熟卵母细胞的重要途径，但现有体外成熟培养体系生产的卵母细胞质量和发育潜能远低于体内成熟的卵母细胞[1]。因此，研究卵母细胞成熟机制，优化体外成熟培养体系，提高卵母细胞质量具有重要的实际应用价值。Sirt2 是进化上保守的沉默信息调节因子（Sirtuins）家族中的一员，为依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（ΝAD+）活性的一种组蛋白去乙酰化酶。Sirt2 广泛表达于哺乳动物的多种组织和器官，主要位于细胞质[2]。近年来研究表明Sirt2 在调节卵母细胞成熟过程中发挥着重要作用[3-4]。抑制Sirt2 活性会引发小鼠卵母细胞纺锤体异常、染色体错配，导致减数分裂阻滞[5]；促进Sirt2 表达可提高卵母细胞的抗氧化能力，减少细胞凋亡，改善衰老引起的卵母细胞缺陷，有利于卵母细胞成熟[6]。本文主要综述了Sirt2 的生物学特性及其在哺乳动物卵母细胞成熟过程的作用与调节机制，以期为提高哺乳动物卵母细胞体外发育能力的研究提供理论基础。

1 Sirt2 的生物学特性

1.1 Sirt2 结构 Sirt2 由催化核心区域、Ν 末端和C 末端调节区域三部分组成。催化核心区域包括一大一小2个结构域：大结构域是经典的Rossmann 折叠结构域，可结合ΝAD+，保守性相对较高；小结构域由锌指结构和螺旋结构组成，主要起到稳定结构域的作用，保守性相对较低。大小结构域由4 个环连接，构成底物结合口袋和催化活性中心。Ν 末端和C 末端调节区域可辅助提高Sirt2 的去乙酰化酶活性[7]。

1.2 Sirt2 活性的影响因素 ΝAD+是Sirt2 催化的去乙酰化反应所必需的辅酶，其浓度可直接影响Sirt2 活性[8]。此外，Sirt2 活性也可通过翻译后修饰调节。组蛋白乙酰转移酶p300 可直接乙酰化Sirt2，进而抑制Sirt2 的去乙酰化酶活性[9]。酪氨酸激酶c-Src 可使Sirt2 的第104 位酪氨酸磷酸化从而减弱其去乙酰化酶活性，并降低Sirt2 蛋白的稳定性[10]。除乙酰化和磷酸化修饰外，泛素化修饰也可调节Sirt2 活性。Choi 等[11]研究发现，泛素连接酶Cbl 可通过泛素化提高Sirt2 蛋白水平和稳定性。

1.3 Sirt2 的作用底物 Sirt2 可以组蛋白为底物发挥去乙酰化作用，调控细胞内染色体的结构修饰和基因表达。Sirt2 在细胞周期G2/M 转换期由细胞质迁移至细胞核，使组蛋白H4 第16 位赖氨酸（H4K16）发生去乙酰化，从而调节细胞中期染色质凝集[12]。Eskandarian 等[13]研究表明，在单核细胞李斯特氏菌感染的情况下，Sirt2可使H3K18 去乙酰化并调控相关基因的转录。另有研究发现，Sirt2 可使H3K56 去乙酰化，从而影响染色体组装与基因合成[14]。

除组蛋白外，Sirt2 也可利用非组蛋白为底物，调控机体生理代谢过程。研究发现，Sirt2 可通过抑制糖异生的限速酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1（PEPCK1）的蛋白酶体降解，在调节碳水化合物代谢中发挥重要作用[15]。此外，柠檬酸裂解酶可被Sirt2 去乙酰化而促进其泛素化和降解，进而调控脂肪酸从头合成[16]。Sirt2 还可使FoxO3a 去乙酰化，从而激活SOD2 和过氧化氢酶诱导抗氧化反应[17]。

2 Sirt2 在哺乳动物卵母细胞成熟过程的作用

2.1 Sirt2 在卵母细胞减数分裂中的作用 精确调控纺锤体装配和染色体分离对于卵母细胞减数分裂的正常进行至关重要。抑制卵母细胞中Sirt2 表达会损害卵母细胞纺锤体及染色体功能，影响卵母细胞成熟，正常卵母细胞纺锤体在MΙ 中期呈典型的双极桶形结构，敲低Sirt2后卵母细胞纺锤体出现异常，甚至未形成纺锤体[5,18]。在MΙΙ 中期，对照组卵母细胞染色体在赤道板上排列整齐，而敲低Sirt2 后不仅染色体发生错位，甚至出现不规则的染色体团块，导致非整倍体产生[5,18]。此外，抑制Sirt2 表达还会造成减数分裂阻滞，SirReal2 是一种有效的Sirt2 抑制剂。研究表明SirReal2 影响牛卵母细胞的正常细胞周期，主要表现为MΙΙ 期卵母细胞比例减少，GV 期、MΙ 期细胞比例增加，并且显著降低体外受精后卵裂率，表明抑制Sirt2 表达影响卵母细胞减数分裂[18]。

2.2 Sirt2 在卵母细胞内细胞器分布中的作用 Sirt2 参与调控细胞质成熟过程中皮质颗粒（CGs）、内质网（ER）和线粒体等细胞器的动态分布。CGs 在卵母细胞成熟过程中不断增多，并逐渐向皮质区迁移，其均匀分布于卵母细胞皮质区通常被认为是细胞质成熟的标志。使用Sirt2 的抑制剂SirReal2 处理卵母细胞后可明显减少CGs 在皮质区的分布[18]。ER 具有调节钙离子动态平衡、蛋白质折叠及参与信号转导等生理功能，对于卵母细胞的发育有重要影响。研究发现，牛GV 期卵母细胞ER定位于皮质区域，MΙΙ 期卵母细胞ER 聚集呈小簇，均匀分布于细胞质内，若ER 分布异常则会严重影响卵母细胞质量[19]。SirReal2 处理牛卵母细胞后可剂量依赖性地降低ER 在细胞质中分布的百分比，干扰ER 的正常分布，从而影响卵母细胞正常发育[18]。线粒体是卵母细胞的能量代谢中心，可为卵母细胞生长和发育提供能量来源。抑制Sirt2 表达会破坏线粒体在细胞质中的正常分布，影响卵母细胞成熟[18]。因此，Sirt2 能够通过调控细胞器分布影响卵母细胞的发育进程。

2.3 Sirt2 在卵母细胞老化中的作用 随着年龄增长，雌性哺乳动物的卵母细胞质量发生不可逆转的下降。Sirt2 的表达在卵母细胞和卵丘细胞老化过程中呈下降趋势[6,20]。研究表明Sirt2 表达量降低是导致卵母细胞年龄依赖性损伤的众多因素之一，老化卵母细胞的活性氧（ROS）水平激增，抗氧化能力降低，而过表达Sirt2 可使老龄小鼠卵母细胞的ROS 水平降低，恢复卵母细胞的发育能力[5-6]。卵母细胞老化伴随着细胞凋亡，抑制Sirt2表达会造成老化卵母细胞的凋亡率显著增加。此外，细胞自噬水平也受Sirt2 表达的影响。抑制Sirt2 表达可通过上调自噬标志物LC3 ΙΙ/LC3 Ι 比值和降解自噬底物SQSTM1，增加老化卵母细胞的自噬活性，诱导卵母细胞加速降解细胞质和细胞器[21]。众多研究表明，卵母细胞老化损伤可通过过表达Sirt2 得以缓解[5,6,22]。此外，褪黑素[23-24]、咖啡因[25]、烟酰胺单核苷酸[6]等物质可通过调控Sirt2 减缓卵母细胞的老化。

2.4 Sirt2 在颗粒细胞功能中的作用 卵泡颗粒细胞包括壁层颗粒细胞和卵丘细胞，其对于卵母细胞成熟和发育均具有重要作用。Sirt2 与类固醇激素的合成有关，在牛颗粒细胞培养过程中干扰Sirt2 表达会诱导孕酮分泌，抑制雌二醇、睾酮的分泌，PPARs/LXRα通路也受到抑制，表明Sirt2 可参与调控类固醇激素生成[26]。此外，Sirt2 参与维持卵丘细胞与卵母细胞间的缝隙连接的信息通讯（GJΙC）。卵母细胞发育所需营养以及调控信号都要通过卵母细胞与卵丘细胞间的GJΙC 来实现，缺失缝隙连接蛋白的小鼠卵母细胞不能正常减数分裂[27]。在牛卵丘卵母细胞复合体（COCs）中，Sirt2 通过下调MEK/ERK 信号通路抑制缝隙连接蛋白43（Cx43）磷酸化，从而提高Cx43 通道的通透性，促进卵母细胞和卵丘细胞之间的信息交流[28]。Sirt2 还可通过使COCs中的Cx43 去乙酰化，改变Cx43 的膜定位，从而调控GJΙC[28]。因此，Sirt2 能够通过调控颗粒细胞的激素分泌及GJΙC，从而影响卵母细胞成熟。

3 Sirt2 调节卵母细胞成熟的机制

3.1 Sirt2 调节组蛋白和微管蛋白乙酰化状态 组蛋白是染色质的主要组成成分之一，可通过发生乙酰化、甲基化、磷酸化等共价修饰参与染色质构象的调节。Sirt2在G2/M 过渡阶段穿梭到细胞核，使H4K16 去乙酰化，从而使染色质的构型更为紧密[12]。敲低小鼠卵母细胞Sirt2 后，H4K16 乙酰化急剧增加，抑制染色质纤维的折叠，影响染色质高级结构的形成，从而干扰减数分裂过程中染色体的正常分离[5]。

微管蛋白是纺锤体的主要组成部分，是最丰富的非组蛋白之一，正常纺锤体的装配和功能需依赖微管动力学的调控，微管通过动粒与染色体着丝粒连接参与染色体分离过程。敲低小鼠卵母细胞的Sirt2 后，出现大量游离的着丝点，造成着丝粒-微管间的稳定性降低[5]。BubR1是纺锤体组装检验点（SAC）的主要成分。Qiu 等[29]研究发现，Sirt2 通过去乙酰化SAC 蛋白BubR1-K243影响着丝粒-微管之间的相互作用。另有研究表明，RAB35/RAB23/KΙF17/KΙF18a 等蛋白能够通过影响Sirt2 调控微管蛋白乙酰化水平变化[30-32]。因此，Sirt2能够通过影响组蛋白和微管蛋白乙酰化状态，调控染色体分离与纺锤体组装，促进卵母细胞成熟。

3.2 Sirt2 调节氧化应激 Sirt2 可通过调控卵母细胞的抗氧化能力抵抗氧化应激，影响卵母细胞成熟。ROS是影响卵母细胞质量和发育潜能的主要因素之一，过多的 ROS 会影响卵母细胞成熟并阻滞胚胎发育。而细胞抗氧化系统成分，如超氧化物歧化酶（SOD）、锰超氧化物歧化酶（MnSOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽（GSH）等，可使卵母细胞避免体外成熟过程中ROS诱导的有害作用。Xu 等[18]研究发现，抑制牛卵母细胞中Sirt2 的表达可乙酰化FoxO3a，降低其下游抗氧化基因SOD2和CAT的表达，导致氧化还原稳态的紊乱。反之，促进Sirt2 表达可引起FoxO3a 去乙酰化，提高其与DΝA 的结合活性，进而提高MnSOD 的表达[33-34]。卵母细胞发育过程中能够产生大量葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD），G6PD 可通过促进ΝADPH 的生成，产生GSH 抵抗氧化应激[35]。过表达Sirt2 的小鼠卵母细胞中G6PD 的活性显著升高，ROS 水平降低，提高了细胞的抗氧化能力[7]。另外，Lamas-Toranzo 等[36]研究表明，Sirt2 可通过去乙酰化并激活G6PD 活性提高牛卵母细胞的发育能力。

3.3 Sirt2 调节线粒体能量代谢 卵母细胞能量代谢受损是导致卵母细胞质量降低的主要因素之一。线粒体是细胞质中含量最为丰富的细胞器，是细胞的能量加工厂，葡萄糖、脂肪酸、氨基酸等转化为乙酰CoA，最终都会转入线粒体的氧化呼吸链，合成ATP。因此，确保正常线粒体功能对于维持卵母细胞能量代谢至关重要。研究发现，Sirt2 会影响线粒体合成，线粒体转录因子A（TFAM）能够调控线粒体DΝA 拷贝数和转录活性，抑制卵母细胞中Sirt2 表达则会导致TFAM 的表达下调，影响线粒体生物合成的正常运行[18]。Sirt2 还能够调控线粒体分裂-融合动力学，抑制Sirt2 表达会使线粒体融合蛋白2（Mfn2）表达下调以及线粒体分裂蛋白1（DRP1）表达上调，使线粒体的融合与分裂失衡，从而引起自身形态和功能的紊乱[18]。此外，Sirt2 能够调控线粒体中ATP 的合成。Xu 等[18]研究发现，牛卵母细胞体外成熟过程中，抑制Sirt2 表达会导致线粒体膜电位降低、ROS 水平升高，从而影响ATP 的生成。总之，Sirt2 能通过影响线粒体功能调控卵母细胞能量代谢。

4 结语

Sirt2 作为一种去乙酰化酶，能够通过影响卵母细胞的乙酰化状态、抗氧化能力、能量代谢等多个方面，参与调控卵母细胞成熟，其为减缓卵母细胞衰老、提高卵母细胞及胚胎质量提供了重要思路。因此，开发和优化Sirt2 激活剂对于动物胚胎生产、人类因年龄引起的不孕症等方面具有重要的应用前景。但Sirt2 在不同的物种中的作用效果还需进一步研究。此外，Sirt2 是否可通过影响其他上下游分子和调节通路，从而影响动物生殖能力，仍需要进一步探讨。