康复新凝胶剂对小鼠创面组织修复的作用及相关机制探讨

薛尧 展冠军 马静

[摘要]目的：观察康复新凝胶剂对小鼠皮肤创面损伤的作用，并探讨其可能的作用机制。方法：60只C57BL/6J小鼠随机分成模型组、康复新凝胶剂组（凝胶剂组）、林可霉素利多卡因凝胶剂组（林可霉素組），每组20只，采用全层皮肤切除法在C57BL/6J小鼠背部制备伤口，伤口造模后开始按组对应给药10d;于治疗第3、7、10天拍照观察伤口图像并计算创面愈合率;酶联免疫吸附法（ELISA）检测血液中白细胞介素-6（IL-6）与转化生长因子-β（TGF-β）的含量;于治疗后第10天处死各组小鼠，苏木精-伊红染色法（HE）观察创面组织变化;免疫组化染色检测创面组织血管内皮生长因子（VEGF）、M1型巨噬细胞标志物（iNOS）与M2型巨噬细胞标志物（CD206）蛋白表达;荧光定量PCR（qRT-PCR）检测创面组织中IL-6、TGF-β、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）与白细胞介素-10（IL-10）mRNA表达水平。结果：与模型组比较，康复新凝胶剂组小鼠于治疗后第3、7、10天伤口愈合较为明显，创面愈合率显著增加，差异有统计学意义（P<0.05）;血清中IL-6含量显著下降且TGF-β含量显著升高（P<0.05）。治疗10d后，与模型组比较，康复新凝胶剂组小鼠创面炎性细胞浸润明显，新生致密肉芽组织，有大量新生毛细血管形成，同时VEGF阳性表达率显著增加（P<0.05），IL-6、TNF-α mRNA表达水平显著下降（P<0.05），IL-10、TGF-β mRNA表达水平显著升高（P<0.05），iNOS阳性细胞数显著减少而CD206阳性细胞数显著增加（P<0.05），且与林可霉素利多卡因凝胶剂作用等效。结论：康复新凝胶剂能够促进小鼠伤口愈合，减轻伤口部位炎症反应，其机制可能与创面巨噬细胞表型转化有关。

[关键词]创面损伤;康复新凝胶剂;林可霉素利多卡因凝胶剂;巨噬细胞;炎症反应

[中图分类号]R622    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2021）04-0110-05

Study on the Effect and Related Mechanism of Kangfuxin Gel on the Repair of Mice Wound Tissue

XUE Yao，ZHAN Guan-jun，MA Jing

[Department of Pharmacy，Nanjing Dachang Hospital（Jiangbei Campus of Zhongda Hospital Affiliated to Southeast University），Nanjing 210048，Jiangsu，China]

Abstract： Objective  To observe the effect of Kangfuxin Gel on skin wounds in mice and explore its possible mechanism. Methods  60 C57BL/6J mice were randomly divided into the model group， the Kangfuxin gel group （gel group） and the lincomycin lindocaine gel group （lincomycin group）， 20 mice in each group. Used full-thickness skin excision method to prepare wounds on the back of C57BL/6J mice. After wound modeling， start to administer drugs according to the group for 10 days. Taked pictures and observe wound images on the 3， 7 and 10 days of treatment and calculate the wound healing rate. Detectted the levels of interleukin-6 （IL-6） and transforming growth factor-β （TGF-β） in the blood by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. The mice of each group were sacrificed on the 10th day after treatment. Hematoxylin-Eosin staining method （HE） observes the changes of wound tissue. Immunohistochemical staining was used to detect the protein expression of vascular endothelial growth factor （VEGF）， M1 macrophage marker （iNOS） and M2 macrophage marker （CD206） in wound tissue. Fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR） was used to detect the mRNA expression levels of IL-6， TGF-β， tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-10 （IL-10） in wound tissues. Results  Compared with the model group， mice in the Kangfuxin gel group had more obvious wound healing on the 3， 7 and 10 days after treatment， the wound healing rate increased significantly， the differences were statistically significant （P<0.05）. The serum IL-6 content decreased significantly and the content of TGF-β increased significantly （P<0.05）. After 10 days of treatment， compared with the model group， the inflammatory cell infiltration in the wound surface of the Kangfuxin gel group was obvious， new dense granulation tissue， a large number of new capillaries were formed， and the VEGF positive expression rate was significantly increased （P<0.05）， IL-6 and TNF-α mRNA expression levels decreased significantly （P<0.05）， IL-10 and TGF-β mRNA expression levels increased significantly （P<0.05）， the number of iNOS positive cells decreased significantly while the number of CD206 positive cells increased significantly （P<0.05）， and was equivalent to lincomycin and lindocaine gel. Conclusion  Kangfuxin gel can promote wound healing in mice and reduce the inflammatory response at the wound site. The mechanism may be related to the phenotypic transformation of macrophages on the wound surface.

Key words： wound injury; Kangfuxin gel; Lincomycin lidocaine gels; macrophage; inflammatory reaction

皮肤持续暴露于外部极易受到各种创伤，皮肤受伤后会触发一系列复杂生理病理过程来进行创面愈合，主要涉及以下四个阶段：凝血，炎症，迁移-增殖和重塑，任何一个阶段功能出现障碍都会导致伤口愈合受阻[1-3]。创面若不能有效、快速愈合，则会导致继发感染甚至引发死亡[4]，严重影响着患者的生活质量与健康，探究加速创面愈合并改善愈合质量的新策略对于患者来说至关重要。巨噬细胞是源于血液系统中的单核细胞，也是先天性免疫的重要组成部分。研究表明，巨噬细胞及其分泌的相关因子在创面愈合的所有阶段均发挥着至关重要的作用[5-7]。巨噬细胞活化后可被分为两种不同的表型，即M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞。研究表明，在创面的炎症发生发展过程中，巨噬细胞的表型转化直接影响着创面愈合的速度与质量[8]。康复新凝胶剂是由大蟾干燥虫体的乙醇提取物制成的外用制剂，其液体制剂具有激活创面免疫活性细胞、调节炎性反应以及快速促进伤面愈合的作用[9]。本研究旨在观察康复新凝胶剂对小鼠皮肤创面的促愈合作用，通过对伤口部位进行组织学及分子生物学分析，探讨康复新凝胶剂促创面愈合的机制。

1  材料和方法

1.1 实验动物与试剂：清洁级C57BL/6J雄性小鼠，6～8周龄，体质量（22±3）g，购自东南大学实验动物中心。康复新凝胶剂参考罗诚等的方法[10]进行制备，林可霉素利多卡因凝胶剂（批号：160601）购自上海新亚药业闵行有限公司，ELISA试剂盒、HE染色试剂购自上海碧云天生物研究所，免疫组化染色试剂购自北京中杉金桥公司，Trizol 试剂、Prime ScriptTM RT reagent Kit及SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒购自日本Takara公司，大鼠单克隆抗VEGF、兔单克隆抗 iNOS与兔单克隆抗CD206购自美国Abcam公司，HRP标记山羊抗兔IgG购自武汉谷歌生物科技有限公司，其他试剂均用国产分析纯。

1.2 动物造模：C57BL/6J小鼠通过腹腔注射10%水合氯醛（0.3ml/100g）麻醉后，进行消毒处理，在小鼠背面脊梁两侧用无菌手术刀切直径1.6cm大小的全层皮肤创面，深度达皮下深筋膜，切割后，无菌纱布压迫止血，用凡士林油纱布覆盖伤口，防止创面干燥，并使用医用胶布固定。将小鼠独笼饲养，期间自由饮水与进食。2d后小鼠出现精神萎靡，且背部创面有脓性分泌物，则表示造模成功。

1.3 动物分组与处理：将60只C57BL/6J小鼠随机分成3组，分别为模型组、康复新凝胶剂组（凝胶剂组）、林可霉素利多卡因凝胶剂组（林可霉素组），每组20只。各组小鼠进行造模，造模成功后，生理盐水擦洗小鼠创面，凝胶剂组和林可霉素组小鼠创面分别予以0.1ml康复新凝胶剂、林可霉素利多卡因凝胶剂处理，模型小鼠创面贴敷生理盐水。每天换药1次，直至处死。

1.4 创面愈合率测定：分别于治疗后第3、7、10天检测各组小鼠创面愈合情况，对小鼠的创面进行拍照，用Image-ProPlus软件进行测定分析，计算创面愈合率。创面愈合率（%）=（原始创面总面积-未愈合创面面积）/原创面总面积×100%。

1.5 ELISA检测血清中IL-6与TGF-β的含量：分别于治疗后第3、7、10天各组小鼠心脏取血，血液在室温下静置30min，通过冷冻离心机中以3 500r/min离心15min，吸取上清。按小鼠IL-6与TGF-β ELISA试剂盒说明书操作步骤，于酶标仪450nm处测定OD值，计算IL-6与TGF-β含量。

1.6 组织学观察：于治疗后第10天处死各组小鼠，以创面为中心，距创面边缘向外2mm切取组织。将组织分成两半，一半放置于液氮后保存于-80℃，另一半以4%多聚甲醛固定，用于病理标本制作。创面组织经4%多聚甲醛固定后，进行常规石蜡包埋，制成厚度为4μm的切片，常规脱蜡水化后，进行HE染色：苏木精染色5min，流水冲洗后，伊红染色3min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，自然风干，中性树胶封片，于光镜下观察组织中炎性细胞浸润、新生毛细血管量、肉芽组织生成情况。

1.7 免疫组化检测创面组织VEGF、iNOS与CD206表达：于治疗后第10天检测各组小鼠创面组织VEGF、iNOS与CD206的蛋白表达情况。创面组织经4%多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片后，进行常规脱蜡水化。放入抗原修复液中高温下进行修复，室温自然冷却后PBS冲洗，并滴加3% H2O2作用20min，PBS再次洗涤后，滴加稀释的大鼠单克隆抗VEGF（1：100）、兔单克隆抗iNOS（1：80）、兔单克隆抗CD206（1：200）为一抗，4℃下孵育过夜，次日PBS洗涤后，滴加对应的二抗工作液，在室温孵育60min后，PBS冲洗，滴加DAB显色3min，经苏木素复染2min，梯度酒精脱水、二甲苯透明后，用中性树脂封片，在光学顯微镜下观察并采集照片。

1.8 qRT-PCR检测创面组织中IL-6、TNF-α、IL-10与TGF-β mRNA表达：根据RNA提取试剂盒提取创面组织总RNA，采用紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度。利用反转录试剂盒Prime ScriptTM RT reagent Kit将提取的RNA 反转录为cDNA，qRT-PCR法检测创面组织中IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β mRNA的表达情况，根据SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ说明书进行操作，以GAPDH为内参。反应条件为95℃ 30s（1个循环），95℃ 5s、60℃ 30s（40个循环）。采用2-ΔΔCt法来计算各基因mRNA的相对表达量。使用的引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.9 统计学分析：本研究采用SPSS 19.0统计软件计算所得数据，实验数据均以均数±标准差（x?±s）表示，两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用One-way ANOVA进行，P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1 康复新凝胶剂对创面愈合率的作用：分别于治疗后第3、7、10天检测各组小鼠创面愈合情况，结果如图1、表2所示，第3天各组小鼠伤口开始愈合，林可霉素组和凝胶剂组小鼠的创面愈合率显著高于模型组小鼠创面愈合率，差异有统计学意义（P<0.05）。给药第7天，各组小鼠伤口均变小，与模型组比较，林可霉素组和凝胶剂组小鼠的创面愈合率显著增加（P<0.05）。第10天各组小鼠创面愈合情况更明显，林可霉素组和凝胶剂组创面基本愈合，模型组仍有痂皮，林可霉素组和凝胶剂组创面愈合率与模型组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。

2.2 各组小鼠血清中IL-6与TGF-β含量比较：各组小鼠血清中IL-6与TGF-β含量检测结果如表3所示，第3、7、10天林可霉素组和凝胶剂组小鼠血清中IL-6含量较模型组小鼠显著下降，同时TGF-β含量较模型组显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.3 各组小鼠创面组织观察：HE染色结果显示，损伤后第10天，模型组创面炎性细胞稀疏，肉芽组织形成较少，新生毛细血管量少;与模型组比较，林可霉素组和凝胶剂组创面表皮增厚，炎性细胞浸润明显，新生致密肉芽组织，有大量新生毛细血管形成。

2.4 各组小鼠创面组织VEGF表达比较：VEGF表达结果如图4所示，模型组VEGF阳性细胞着色较浅，林可霉素组和凝胶剂组VEGF阳性细胞着色较深且分布广，林可霉素组和凝胶剂组VEGF阳性表达率分别为（25.73±4.15）%、（29.48±4.14）%，较模型组VEGF阳性表达率[（8.41±1.62）%]显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.5 各组小鼠创面组织M1型和M2型巨噬细胞分泌的细胞因子表达比较：qRT-PCR检测结果如表4所示，损伤第10天，林可霉素组和凝胶剂组IL-6、TNF-α mRNA表达水平较模型组显著下降，差异有统计学意义（P<0.05）;而IL-10与TGF-β mRNA表达水平显著高于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.6 各组小鼠创面组织iNOS与CD206表达：免疫组化染色结果如图5～6所示，林可霉素组和凝胶剂组iNOS阳性细胞分布稀疏、着色较浅，模型组iNOS阳性细胞分布较广泛，着色较深，林可霉素组和凝胶剂组iNOS阳性细胞数显著低于模型组iNOS阳性细胞数，差异有统计学意义（P<0.05）;模型组CD206阳性细胞的分布较为稀疏，林可霉素组和凝胶剂组CD206阳性细胞着色深且分布范围广，林可霉素组和凝胶剂组CD206阳性细胞数显著高于模型组CD206阳性细胞数（P<0.05）

3  讨论

目前，各类因素导致的外伤性创面损伤的发生率越来越高。在创面愈合过程中，各级反应错综复杂而又相互协同，炎症反应作为创面修复的第一阶段，在组织受损后开始，过程涉及凝血级联反应、炎症途径和免疫系统相关反应[3]。修复的第二阶段发生在创伤后2～10d内，其特征是不同类型的细胞发生增殖和迁移以及血管的生成，该过程主要受血管内皮生长因子A和成纤维细胞生长因子2的调节[11]。毛细血管的扩散为成纤维细胞和巨噬细胞带来营养和氧合作用，通过肉芽组织代替纤维蛋白基质，并形成角质成为细胞迁移的底物，直到恢复上皮屏障为止[12]。修复的第三阶段为重塑过程，通常在损伤后2～3周内开始，可以持续1年以上，在此阶段，大多数内皮细胞、巨噬细胞和成肌纤维细胞进入细胞凋亡期，导致纤维化肿块[13]，其特征为胶原蛋白和其他细胞外基质蛋白的活力降低。

创面愈合率是评估创面愈合情况最直观的指标。本研究结果表明，康复新凝胶剂作用下小鼠创面愈合率得以提高。肉芽组织由成纤维细胞和新生的毛细血管组合构成，在组织损伤修复过程中可填充于伤口部位，通过抵抗感染与包裹炎性渗出物来保护创面，从而在伤口愈合向组织重塑的过渡提供了有利条件[14]。本研究通过创面组织病理染色，观察到在康复新凝胶剂治疗下，小鼠创面炎性细胞浸润明显，有大量新生毛细血管形成，肉芽组织致密较厚，由此说明康复新凝胶剂促进了小鼠的创面修复。

巨噬细胞的特征在于其可塑性高，根据情况表现出不同的表型和功能。M1巨噬细胞具有促炎作用，可分泌促炎因子如IL-6、TNF-α，能够促进T辅助细胞1（Th1）应答并具有抑制肿瘤活性的作用[15]。M2巨噬细胞有助于组织修复，分泌抑炎因子如IL-10、TGF-β以及生长因子VEGF等[16]。巨噬细胞向表型M1或M2的极化是一个动态且可逆的过程，在不同生理病理条件下会发生变化。在皮肤伤口愈合的阶段，伤口部位炎症反应过度，导致大量M1型巨噬细胞持续存在于伤口部位，并难以转化为能够促进愈合的M2型巨噬细胞，导致疮面修复困难[17-19]。在本研究中，在康复新凝胶剂作用下，qRT-PCR結果显示小鼠创面组织中IL-6、TNF-α mRNA表达水平降低，而IL-10与TGF-βmRNA表达水平升高。此外，免疫组化染色同样显示，iNOS阳性细胞数减少且CD206阳性细胞数增加，VEGF阳性表达率升高。这些结果均表明，康复新凝胶剂作用于创面后可促进巨噬细胞向M2型极化，同时抑制巨噬细胞向M1型极化，从而改善创面部位巨噬细胞表型异常的现象。

综上所述，康复新凝胶剂可促进小鼠创面愈合，有利于创面肉芽组织与新生毛细血管的形成，其机制可能与促进巨噬细胞表型转化相关。结合当前创面愈合困难的现状，研发外用的愈合剂具有实用价值，本研究可为皮肤创面治疗提供实验依据，但目前康复新凝胶剂相关研究报道较少，其促进创面愈合的机制仍需进一步的深入研究，以期应用于临床治疗。

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[收稿日期]2020-06-22

本文引用格式：薛尧，展冠军，马静.康复新凝胶剂对小鼠创面组织修复的作用及相关机制探讨[J].中国美容医学，2021，30（4）：110-114.