超声波辅助提取鱼腥草总黄酮的工艺研究

黄明才，韦国兰，龙杰凤，王 翔，陆勤猛

（凯里学院，贵州 凯里 556011）

鱼腥草为三白草科植物蕺菜Houttuynia cordataThunb.的新鲜全草或干燥地上部分，始载于《名医别录》，是一种药食两用的植物.《中国药典》中记载鱼腥草具有清热解毒、消痈排脓、利尿通淋等功效，临床上用于治疗肺痈吐脓、痰热喘咳、热痢、热淋、痈肿疮毒等疾病［1］；在食用上常以炒、凉拌等方式见于云贵川几大省份人民的餐桌上.鱼腥草主要含黄酮、挥发油、酚酸、萜类、生物碱等成分［2-3］，现代药理研究表明鱼腥草中黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗诱变和清除自由基等功能［4］.本试验以鱼腥草为原料，采用超声波辅助提取法对鱼腥草中总黄酮提取工艺进行优化，以期为鱼腥草的进一步研究提供技术依据.

1 试验材料、试剂、仪器与方法

1.1 试验材料与试剂

样品鱼腥草购于凯里市中药材市场，去杂质清洗后晒干，置于烘箱中60℃干燥至恒重，再放入高速万能粉碎机中进行粉碎，过40 目筛，得到40 目样品粉末放入密封袋避光保存，待用.所用试剂为芦丁、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯等.

1.2 试验仪器

本试验所用仪器有电热鼓风干燥箱（WGLL-230BE，天津市泰斯特仪器有限公司），高速万能粉碎机（FW400A，北京科伟永兴仪器有限公司），超声波清洗机（JP-040，深圳市洁盟清洗设备公司），低速离心机（TD5M，长沙湘智离心机仪器有限公司），紫外分光光度计（UV-2550，岛津企业管理中国有限公司），电子天平（AR224CN，奥豪斯仪器（常州）有限公司）等.

1.3 试验方法

1.3.1薄层色谱鉴别

取鱼腥草粉末0.4 g放入50 mL 的小烧杯中，然后加入10 mL 甲醇封口超声5 min 后放至室温过滤，滤液保存作为供试品.

精确称量8.0 mg芦丁粉末，放入锥形瓶，然后加入2.0 mL甲醇得到对照品溶液（4 mg/mL）.

硅胶G 薄板层110 ℃下活化120 min，用毛细管蘸取样品溶液点样，在G 薄板层取5 个点分别在1、3、5 号点上点入供试品，在2、4 号点上点入对照品，然后放入盛有展开剂乙酸乙酯∶甲酸∶水（8∶1∶1）的展缸中，10～30 min后取出，放置烘箱烘干，然后在薄层板喷上三氯化铝溶液，放入暗箱三用紫外线分析仪在紫外灯365 nm 下检视［5］.结果可见对照品与供试品在相应的位置下显示颜色相同的绿色荧光斑点，证明鱼腥草中含有黄酮成分.

1.3.2测定波长的选择

精密称取1.2 mg 的芦丁对照品，加入100 mL 的容量瓶中，加入乙醇稀释至刻度，即配制浓度为0.012 mg/mL的芦丁对照品，在紫外-可见光光谱仪200～800 nm波长下扫描，结果在512 nm处有最大吸收峰，因此在测定鱼腥草总黄酮含量时，在此波长处测定.

1.3.3标准曲线的绘制

芦丁标准曲线的制作参照文献［6］：准确称取0.126 g 芦丁标准品于150 mL 烧杯中，并用100 mL 的70%乙醇溶液溶解后转移至1000 mL 容量瓶中，并定容至刻度，摇匀静置.分别吸取该标准溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于5 个25 mL 比色管中，再分别加入70%乙醇溶液至5.0 mL，混合均匀，再加入5%亚硝酸钠溶液0.5 mL，混合均匀，静置6 min，加入0.5 mL 10%硝酸铝溶液，混合均匀，放置6 min，再加入4 mL 4%氢氧化钠溶液，混合均匀.放置15 min，并于510 nm 波长处测定其吸光度.以芦丁浓度（X）为横坐标，吸光度（Y）为纵坐标，绘制标准曲线.其回归方程为Y=11.701X-0.0057（R²=0.9996）.由此可见，此方程线性良好.

1.3.4鱼腥草总黄酮得率的结果计算

鱼腥草总黄酮得率通过以下公式计算：总黄酮得率（%）=（C×V×稀释倍数）×100/M，式中C为标准样液浓度（mg/mL），V为样品体积（mL），M为称取样品质量（mg）

1.3.5鱼腥草总黄酮提取的单因素考察

1.3.5.1料液比对鱼腥草总黄酮提取的影响

精密称取2.0 g鱼腥草粉末5份，放入相应的5个250 mL圆底烧瓶中，以40%乙醇溶液为提取剂，以按1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25为料液比，用保鲜膜封口，在温度为40 ℃条件下超声提取15 min 后放置室温，抽滤，滤液转入100 mL容量瓶定容至刻度，根据1.3.3测定其吸光度.

1.3.5.2乙醇浓度对鱼腥草总黄酮提取的影响

精密称取2.0 g 鱼腥草粉末5 份，放入相应的5 个250 mL 圆底烧瓶中，按固定料液比为1∶10比例分别加入50%、60%、70%、80%、90%浓度的乙醇，用保鲜膜封口，在温度为40 ℃条件下超声提取15 min后放置室温，抽滤，滤液转入100 mL容量瓶定容至刻度.根据1.3.3测定其吸光度.

1.3.5.3提取时间对鱼腥草总黄酮提取的影响

精密称取2.0 g鱼腥草粉末5份，放入相应的5个250 mL圆底烧瓶中，按固定料液比为1∶10加入70%的乙醇，用保鲜膜封口，在温度为40 ℃条件下超声提取时间依次为15、30、45、60、75 min后，放置室温，抽滤，滤液转入100 mL容量瓶定容至刻度，根据1.3.3测定其吸光度.

1.3.5.4提取温度对鱼腥草总黄酮提取的影响

精密称取2.0g鱼腥草粉末5份，放入相应的5个250 mL圆底烧瓶中，按固定料液比为1∶10加入70%的乙醇，设置超声温度分别为40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃，超声提取30 min 后，放置室温，抽滤，滤液转入100 mL容量瓶定容至刻度，根据1.3.3测定其吸光度.

1.3.6正交试验设计

在单因素试验的基础上，采用L9（34）正交实验优化提取工艺参数，因素水平表见表1.

表1 正交试验因素水平表

2 结果与分析

2.1 因素试验结果

2.1.1料液比对鱼腥草总黄酮提取的影响

根据图1 可知，当料液比为1∶5 至1∶10 时，提取所获的总黄酮得率逐渐增大，当料液比为1：10时总黄酮得率最大，随后慢慢降低，故正交试验设计中选取提取料液比为1∶5～1∶15.

图1 料液比不同对总黄酮提取的影响

2.1.2乙醇浓度对鱼腥草总黄酮提取的影响

根据图2 可知，当乙醇浓度为50%～70%时，提取所获的总黄酮得率逐渐增大，当料液比为70%时总黄酮得率最大，随后慢慢降低，故正交试验设计中选取提取乙醇浓度为60%～80%.

图2 不同乙醇浓度对总黄酮提取的影响

2.1.3提取时间对鱼腥草总黄酮提取的影响

根据图3 可知，当超声提取时间为15～30 min 时，提取所获的总黄酮得率逐渐增大，当超声提取时间达30～45 min时，总黄酮得率没有变化，这时得率最大，45 min后总黄酮得率逐渐降低，故正交试验设计中选取提取时间为15～45 min.

图3 提取时间不同对总黄酮提取的影响

2.1.4提取温度对鱼腥草总黄酮提取的影响

根据图4 可知，当提取温度在40℃～50℃时，提取所获的总黄酮得率逐渐增大，当提取温度达50℃时，这时总黄酮得率最大，50℃后总黄酮得率逐渐降低.故正交试验设计中选取提取时间为40℃～60℃.

图4 提取温度不同对总黄酮提取的影响

2.2 鱼腥草总黄酮提取工艺的优化

在单因素试验结果的基础上设计正交试验方案，选取各因素中鱼腥草总黄酮得率较高3 个水平进行正交试验，正交实验结果见表2.

表2 正交试验方案及结果

由表2中极差分析可知，4个因素对鱼腥草总黄酮提取效果影响的主次顺序为A（料液比）＞C（提取时间）＞D（提取温度）＞B（乙醇浓度），最佳工艺为A2B2C3D3，即料液比为1∶10、乙醇浓度为70%、提取时间为45 min、提取温度60℃.故对A2B2C3D3进行验证实验，验证实验结果总黄酮得率为2.53%.

3 结论

本研究在考察单因素料液比、乙醇浓度、提取时间、提取温度的基础上，采用正交设计对鱼腥草总黄酮提取工艺进行优化，得到鱼腥草总黄酮的最佳工艺为A2B2C3D3，即料液比为1∶10、乙醇浓度为70%、提取时间为45 min、提取温度60℃，此方法便捷、快速、低成本，可为鱼腥草的开发提供一定的参考依据.