间作不同绿肥植物组合对茶园土壤改良的效果

赵 茜，施龙清，何海芳，李天璞，李亚勍，张力文，杨 广 *

（1. 闽台作物有害生物生态防控国家重点实验室/福建农林大学应用生态研究所，福建 福州 350002；2. 教育部害虫生态防控国际合作联合实验室，福建农林大学，福建 福州 350002；3. 农业部闽台作物有害生物综合治理重点实验室，福建农林大学，福建 福州 350002；4. 害虫绿色防控福建省高等学校重点实验室，福建农林大学，福建 福州 350002；5. 福建省农业科学院水稻研究所，福建 福州 350019）

0 引言

【研究意义】福建省号称“中国乌龙茶之乡”，是名茶铁观音、武夷岩茶的发源地，福建省海拔1000 m以下的适宜种植茶树的丘陵山区占福建省陆地总面积的83.3%[1]。茶产业发展为福建九大支柱产业之一，有着重要的经济价值[1,2]，土壤作为茶树生长赖以生存的营养来源，其酸化程度对茶树的生长及茶叶的品质有重要影响[2]。茶树虽为喜酸植物，但并非土壤pH值越低越好，当pH值低于4.5时，不仅会抑制茶树生长，还容易导致土壤中的重金属活化[3]。据统计，福建省pH值在4.5以下的茶园占比87%[4]，且茶园土壤酸化有进一步加重的趋势[5]。土壤酸化带来了一系列问题，首先改变了土壤结构并降低土壤缓冲性能，使土壤养分流失，影响茶叶产量、品质等[6]，同时导致土壤对重金属离子的吸附能力，使重金属离子活化，增加重金属的溶解性、有效性和移动性[5,7]，增加了茶树对重金属离子的吸收、固定，最终导致茶叶产品重金属的含量，影响人体健康[1,8]。其次，大多数土壤微生物都对酸敏感[9]，土壤酸化降低了土壤微生物种群数量，且随着pH值的不断降低，土壤微生物的生长活性也会受到明显抑制并影响土壤有机质的分解和氮素的固定[10]。【前人研究进展】目前，土壤重金属修复的方法主要有物理修复法、化学修复法和生物修复法，但这些方法存在工程量巨大、实施成本高且存在二次污染等问题[11]。近年来，植物修复技术作为一种绿色的土壤修复技术，为科学家们所认可并推广，但该技术的实施存在耗时长且必须中断农业生产等问题，不容易在生产中推广[12]。因此选取适当的土壤修复技术，是当前面临的一大难题。间作耕作体系作为现代生态种植最常见的基本模式之一，一直是我国传统农业的精髓[13]。选择适当的绿肥植物形成间作复合体系，以实现对茶园土壤边修复边种植生产，不失为一条绿色修复有效途径。绿肥作为有机肥源，具有改良土壤理化性质、提高土壤肥力的作用，同时还可以增加土壤微生物多样性[14,15]。为此茶园套种绿肥植物不失为一个促使茶树生长、提升茶叶产量、品质的有效方法[16,17]。已有研究表明，圆叶决明（Chamaecrista rotundifolia）因兼具高产、抗旱、生长速度快且匍匐生长等特点[18]，用于茶园间作可提高土壤含水量、有机质含量和改善茶园光、湿、温等小气候条件，可作为山地茶园推广的优良绿肥植物[19]。油菜（Brassica campestris）作为我国南方主要作物，具有抗寒、耐旱、适应性广、种植成本低、生物量大、肥效广等优点，被作为绿肥作物广泛利用[20,21]。羽扇豆（Lupinus perennis）为多年生草本植物，可一年生种植，喜酸性土壤（pH值5.5）[22]。【本研究切入点】但这些植物，特别是其组合对茶园土壤酸化、重金属富集的治理效果和土壤菌群的影响鲜有研究。【拟解决的关键问题】为此开展圆叶决明、油菜和宿根羽扇豆及其组合对茶园土壤改良效果的研究，以期为茶园土壤改良提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 室内绿肥植物间作试验

从50年生以上老茶园中（福建农林大学茶园）挖回种植茶树的红壤土，平均放入24个花盆（长×宽×高为45 cm×20 cm×15 cm）中。将带土花盆放入人工气候室［室内设LED灯光照，光周期为12∶12，温度（28±1） ℃，相对湿度（70±5）%］，并将其随机分为8组，每组3个重复分别进行如下处理：花盆内均匀播种90粒宿根羽扇豆（Lupinus perennis）种子（L组）；花盆内均匀播种90粒油菜（Brassica campestris）种子（B组）；花盆内均匀播种90粒圆叶决明（Chamaecrista rotundifolia）种子（C组）；花盆内混合播种45粒宿根羽扇豆种子和45粒油菜种子（LB组）；花盆内混合播种45粒宿根羽扇豆种子和45粒圆叶决明（LC组）；花盆内混合播种45粒油菜种子和45粒圆叶决明（BC组）；花盆内混合播种30粒宿根羽扇豆种子、30粒油菜种子和30粒圆叶决明（LBC组）；花盆不撒任何间作植物，作为对照组CK（其中间作植物播种时间为2018年3月23日，该时间內收集的对照组土壤标记为CK1；同年6月29日，CK组收集的土壤标记为CK2）。随机采集花盆土壤3管（每管土壤不低于50 g），置于−80 ℃冰箱储存。待3种间作植物花期结束后，即同年6月29日，采集每个花盆内土壤1管（每管土壤不低于50 g），与播种前采集的3管土壤，共计27管进行微生物多样性检测。同时，另取土样进行PH值测定和Cd、Pb、Cr、Cu和Zn、Ni、Hg、As等重金属元素含量检测。

1.2 土壤pH、重金属含量分析

取土样10 g放入50 mL烧杯中，加入25 mL超纯水，用玻璃棒剧烈搅动2 min，静置30 min，用台式pH计［型号：FF28，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司，METTLER TOLEDO］进行检测。每样检测3次后取平均值。

土样中总汞（Hg）和总砷（As）的含量使用原子荧光法进行测定，详细方法参照国家标准《土壤质量总汞、总砷、总铅的测定原子荧光法GB/T 22105.1—2008》；其他6种重金属采用原子吸收分光光度法进行检测，参考标准为《土壤质量 铅、镉的测定石墨炉原子吸收分光光度法 GB/T 17141—1997》《土壤总铬的测定火焰原子吸收分光光度法HJ 491—2009》《土壤质量锌、铜的测定火焰原子吸收分光光度法 GB/T 17138—1997》《土壤质量镍的测定火焰原子吸收分光光度法 GB/T 17139—1997》。

对不同土壤样本的pH和重金属含量差异，利用多重比较（LSR）进行统计。

1.3 土壤微生物DNA的提取和纯化

用 DNeasy PowerSoil Kit（QIAGEN, Inc.,Netherlands）试剂盒进行微生物总DNA的提取，并将提取的DNA保存于−20 ℃冰箱内。分别用NanoDrop ND-1000核 酸 检 测 仪（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）和0.8%琼脂糖凝胶电泳对提取的DNA进行品质检测；同时采用紫外分光光度计对提取的DNA进行定量。

以微生物核糖体RNA等能够反映菌群组成和多样性的目标序列为靶点，根据序列中的保守区域设计相应引物，以稀释后的DNA作为模板，应用带Barcode的特异引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCG CGGTAA-3′）和907R（5′-CCGTCAATTCMTTTRA GTTT-3′）对细菌16S V4区进行PCR扩增，PCR采用25 μL反应体系（使用PCR仪器是Bio-rad T100梯度PCR仪），程序设定为：98 ℃预变性2 min；25个循环（98 ℃变性15 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s）；然后72 ℃延伸5 min。PCR产物使用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。将PCR扩增产物用磁珠纯化回收，操作步骤如下：在25 μL的PCR产物中加入体积0.8倍的磁珠（Vazyme VAHTSTM DNA Clean Beads），震荡充分悬浮后在磁力架上吸附5 min，小心地用移液枪吸出上清；加入20 μL 0.8倍磁珠洗涤液，震荡充分悬浮后放在磁力架上吸附5 min，小心吸出上清；加入200 μL80%乙醇，反向放置在磁力架上，用磁珠吸附到PCR管的另外一面，充分吸附后吸出上清；放在室温中静止5 s，待酒精挥发完全，磁珠出现裂缝即可；加入25 μLElution Buffer洗脱；将PCR管放在吸附架上5 min，充分吸附，移出上清到干净的1.5 mL离心管中保存。将纯化回收的PCR产物进行荧光定量，荧光试剂为Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit，定 量 仪 器 为Microplate reader（BioTek，FLx800）。根据荧光定量结果，按照每个样本的测序量需求，对各样本按相应比例进行混合。

1.4 土壤微生物DNA多样性分析

依照Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制备测序文库流程进行文库制备；通过2%琼脂糖凝胶电泳，对文库做最终的片段选择与纯化。上机测序前，需要先对文库在Agilent Bioanalyzer上进行质检，采用Agilent High Sensitivity DNA Kit。合格的文库有且只有单一的峰，且无接头。质检后，采用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit在Promega QuantiFluor荧光定量系统上对文库进行定量，合格的文库浓度应在2 nmol·L−1以上；将合格的各上机测序文库（Index序列不可重复）梯度稀释后，根据所需测序量按相应比例混合，并经NaOH变性为单链进行上机测序；使用MiSeq测序仪进行双端测序。对照及每个处理组我们分别设计3个生物学重复。

通过质量初筛的原始序列按照index和Barcode信息，进行文库和样本划分，并去除barcode序列。利用FLASH（v 1.2.7）对每个样本的reads进行拼接。本研究主要利用QIIME 和 R（v3.2.0）包对数据进行分析。利用QIIME对物种进行OUT聚类，并计算微生物的多样性指数，包括丰富度指数（CHAO1、ACE）、辛普森多样性指数（Simpson index）、香农多样性指数（Shannon diversity index）。利用R包进行细菌群落间差异性分析（ttest以及Monte Carlo permutation test）。同时，为了降低噪音，选取了丰度前5%的菌落，利用R包（v3.2.0）进行菌落属水平的主成分分析（PCA）。

2 结果与分析

2.1 绿肥植物对室内盆栽茶园土壤pH及重金属的改良

试验开始时对照组（CK1）土样的pH均值为5.90，试验完成后，对照组（CK2）采集土样pH均值为6.03，与试验前的土壤pH无明显差异（表1）。同样，绿肥植物单独种植的3组处理土样（L、B和C处理）pH值与2组对照组差异不显著（表1）。然而，绿肥植物两两组合（LB和BC）间作后，相比对照组，pH值显著提升，说明LB和BC组合对土壤pH改良有显著效果（表1）。然而，3种绿肥植物组合（LBC）间作试验结束后，所采集的土样pH不升反降，pH降为5.30，显著低于对照组（表1）。因此，从土壤酸度改良考虑，宿根羽扇豆-油菜（LB）以及油菜-圆叶决明（BC）的组合对土壤酸碱度提升效果最佳，LBC则起负作用，应谨慎使用。

表1 绿肥植物对土壤pH值及重金属含量的影响Table 1 Effects of intercropping green manures with tea plants on pH and heavy metal contents in pot soil

CK1和CK2的重金属含量比较发现，短期种植茶树就会增加土壤重金属Cd、Zn、Hg和As的含量（表1）。而不同绿肥植物种植可明显改变重金属含量。例如，单一间作宿根羽扇豆或油菜对重金属Cd的有着明显的降低效果（表1、图1-A）。然而，对其他重金属改良效果较差，甚至会增加Cu、Hg、As的重金属含量（表1）。而单一间作绿肥植物圆叶决明可显著改良种植茶树后土壤中Hg的含量，但对其他重金属无改良效果（表1、图1-B）。因此，我们探索了多种绿肥植物组合间作对土壤重金属的改良效果。结果显示，多种绿肥植物间作的效果并没有随着植物数目的增多而效果更好（表1）。仅有LB组合可显著降低种植茶树后土壤重金属Cd和Hg的 含量（表1、图1-B）。

图1 室内不同绿肥植物处理土壤重金属的变化Fig. 1 Effects of intercropping green manures with tea plants on pH and heavy metal contents in pot soil

2.2 绿肥植物对土壤微生物多样性的影响

通过高通量测序数据，共得到1 194 093条有效序列，其中2个对照组土壤的平均有效数据分别为39 436和47 912；处理组L、B、C、LB、LC和LBC的平均有效数据分别为43 476、37 787、41 103、38 133、40 456、63 244和46 484。经过数据库比对分析及注释后，OUT聚类结果显示，OTU数最大值在LBC处理组（2 235.3），最小值在LB处理组（1667.7），且两组OTU数目差异显著（t=3.66,df=3.47,P=0.011），表明不同绿肥植物套种作对于土壤微生物的多样性有显著影响。细菌群落丰度及多样性分析结果显示，选取的这几种绿肥植物间作对于土壤微生物的种 群丰度改良效果并不显著（表2）。

表2 绿肥植物对土壤微生物多样性的影响Table 2 Effects of intercropping green manures with tea plants on bacterial diversity of pot soil

2.3 绿肥植物对土壤细菌群落组成与结构的影响

所有绿肥间作处理组和对照组土壤中的优势菌群均为变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）和芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）。然而，间作绿肥植物可影响土壤细菌群落相对丰度。例如，7个绿肥植物处理组与对照相比，变形菌（Proteobacteria）比例明显升高，成为丰度最高的菌门（图2）；放线菌比例下降明显，特别是在L、LB和LBC处理组中，放线菌比例均下降至不足20%，甚至低于绿弯菌门（Chloroflexi）。此外，对照组中一些含量稀少的菌门在绿肥间作处理组中的含量有明显的上升；例如7个处理组土壤中蓝藻菌（Cyanobacteria）含量从对照组的0.1%～0.3%上升至1%以上（图2）。

图2 室内不同绿肥植物处理土壤微生物群落种类分布Fig. 2 Bacterial community structure in soils of green manures intercropping with tea plants

对丰度前5%的细菌群落，在属水平对群落组成结构进行PCA分析，结果如图3所示，两个对照组土壤微生物群落结构差异较小，而与7组绿肥植物间作土样差异明显。说明绿肥植物间作对于土壤细菌组成结构具有积极的作用。此外，LC，BC间作处理组土壤的细菌群落结构显著区别于其他处理组。表明圆叶决明对于细菌群落结构变化有着重要的作用 （图3）。

图3 室内不同绿肥植物处理土壤微生物群落种类及主成分分析（PCA）Fig. 3 PCA analysis on bacterial community in soils of green manures intercropping with tea plants

3 讨论和结论

间作模式下，绿肥植物与作物的种间互作过程中，酸性磷酸酶活性、根际pH、有机质、氮磷钾营养元素含量等一系列因子的变化可构成土壤环境综合因子，影响土壤的pH值和肥力[20]。例如，在茶园套种油菜可基本满足茶青的生长需求，且种植后土壤有效养分和有机质的改善明显[21]。詹杰等[19]的研究表明，与清耕茶园相比，套种绿肥植物圆叶决明可显著提高茶园的有机质，且可提高茶园土壤的含水量，降低茶园空气温度，增加空气湿度。而我们的研究补充了绿肥植物间作对茶园土壤pH、重金属含量以及茶园菌群、群落结构的影响，探讨茶园间作何种绿肥对土壤的改良作用显著。

我国传统绿肥主要包括固氮的豆科作物[15]。然而，近年来，大量新型绿肥植物被不断开发和应用，包括本研究所用的油菜，羽扇豆以及圆叶决明[15]。油菜作为一种新型绿肥，目前在我国应用还不是很常见[15]。前期研究表明油菜可明显改善早稻、晚稻种植土壤的养分，主要表现在提高土壤有机质的含量、速效钾、速效磷含量[15]。而茶园套种油菜后，根际土和根围土的pH值有明显提高，有利于改善茶园土壤肥力[23]。而羽扇豆是一种集观赏、施用、绿肥和饲料为一体的宿根植物[22]。羽扇豆能够高效利用土壤固态磷，且根瘤菌具有固氮作用，是一种优质的绿肥植物[23]。红壤是南方主要的茶园土地资源，据调查，福建省闽东、闽南、闽北、闽中四大茶区土类类型中红壤占81.3%[24]。因红壤土质黏重、呈酸性、有机质含量少，使其开发利用受到一定限制[24]。因此实现红壤的高效利用，提高红壤肥力，对生态茶园的构建意义重大。近年来，绿肥在土壤增肥中的作用巨大。豆科植物的根瘤菌，具有固氮作用，还能提供丰富的氮素资源[23]。目前羽扇豆与哪些有机肥混施、怎样混施以及不同耕作方式经济效益等方面还研究较少。本研究茶园间作油菜羽扇豆组合（LB）后发现，茶园土壤的PH升高、主要重金属Cd、Hg含量降低，且茶园微生物群落结构也发生明显变化。前人对福建地区茶园重金属污染调查后发现，Hg和Cd污染严重，分别超标1.83倍及1.13倍[24]。此外土壤中重金属含量与茶叶重金属含量具有较强的相关性[23]。因此，降低茶园重金属含量，对于茶的安全生产有积极作用。本研究结果显示，单一绿肥植物间作很难达到降低大部分重金属离子含量的目的。因此，宿根羽扇豆-油菜间作组合（LB）对于改善福建茶园土壤酸化、重金属污染等问题，具有潜在应用价值。

细菌作为土壤多样性最丰富的微生物类群，易受土壤养分、pH等变化而改变[25]。不同植物根际分泌物有着显著差别[26]，绿肥植物根系向土壤中释放大量的物质，而这些物质被分解后可为土壤微生物提供丰富的营养，从而影响土壤微生物的生物群落数量、种群结构等[13]。同时，微生物生物群落数量和活性是影响土壤肥力的一个重要因素[27]。近年来，一些学者提出了富营养和寡营养细菌的概念[28]，并指出β-变形菌纲作为富营养细菌的一种，多存在于营养较高的环境中。本研究发现，与单作茶园土壤相比，间作LB组合后土壤中的变形菌门含量显著升高（图2），这可能是由于间作植物提高了土壤养分含量。总体来看，间作油菜-羽扇豆组合（LB）后对茶园土壤细菌菌落丰度、多样性的影响并不显著，但是却显著改变了细菌群落结构并促进了富营养细菌群落的生长，从而有利于改善茶树种植土壤微生物的生态环境。