曲札茋苷对肾病综合征大鼠的治疗作用及机制

杜世豪,张子惠,谢群玲,徐 浩,宋泽宇,郑 涛,徐佳慧,刘中信,范华英

(烟台大学药学院,新型制剂与生物技术药物研究山东省高校协同创新中心、分子药理和药效评价教育部重点实验室(烟台大学),山东 烟台 264005)

肾病综合征(Nephrotic Syndrome,NS)是慢性肾病(Chronic Kidney Disease,CKD)常见的临床诊断类型,是以高蛋白尿、高血清白蛋白、高血脂和水肿为临床特征的综合征[1]。目前临床上通常使用糖皮质激素、细胞毒性药物和免疫抑制剂治疗NS,但在长期治疗的过程中,通常伴随着严重的不良反应[2]。因此,寻找新的策略治疗NS,或者减少治疗NS过程中的不良反应具有重要的临床意义。

NS的发病机制复杂,目前认为发病原因主要与炎症、免疫和氧化应激等因素有关[3-5]。有研究证明,血液中的促炎症因子白介素6(Interleukin-6,IL-6)和白介素8(Interleukin-8,IL-8)在NS的发病过程中升高[6-7],这些炎症因子可能介导肾功能的损伤,不但促进炎症的发展,还导致肾小球滤过屏障的破坏,加快NS的发病过程[8]。高迁移率族蛋白1(High mobility group box 1,HMGB1)是一种炎症蛋白,能够激活炎症细胞,释放大量炎症因子,从而引发一系列免疫反应[9]。机体内多种疾病的发生都与HMGB1密切相关,包括肾脏疾病、肿瘤以及自身免疫炎症疾病[9-11],而在肾脏疾病中,HMGB1表达水平升高,激活炎症反应,与炎症因子相互促进,引发炎症因子的级联反应,从而加快肾脏疾病的进程[9]。因此,通过药物干预HMGB1的表达,减少炎症因子释放,对于治疗NS有着积极作用。

基于NS的复杂发病机制,天然药物多靶点治疗的特点可能具有显著优势。目前临床上,多种天然药物如人参[12]、丹参[13]等提取物,已经广泛用于治疗肾功能损伤等。曲札茋苷(图1)是从拉萨大黄中提取的一种化合物,生物活性高,具有抑制炎症、清除氧自由基等药理作用[14-15],其广泛的药理作用可能有助于减轻肾功能损伤。因此,为了探讨曲札茋苷与NS的发病机制的联系,本研究利用注射用盐酸多柔比星(Doxorubicin,Dox)诱导的NS大鼠模型[16]评价曲札茋苷对NS大鼠模型的治疗作用。

图1 曲札茋苷结构式

1 实验部分

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 成年雄性SD大鼠30只,180～220 g,购买自济南朋悦实验动物繁育公司,实验动物合格证编号:SYXK(鲁)20190003。实验中所用大鼠均在温度23±1 ℃,湿度55%±5%的条件下饲养,并于实验前进行7 d适应性饲养,给予足够饲料和饮水。本研究经过烟台大学动物伦理委员会批准,实验方案严格按照烟台大学动物伦理委员会的相关规定设计。

1.1.2 实验仪器 全自动血生化分析仪(美国雅培公司),SpectraMax iD3型酶标仪(美国Molecular Devices公司),ST16型离心机(赛默飞世尔科技有限公司),AE224C电子天平(上海舜宇恒平科技有限公司),ImageQuant LAS 4000型超灵敏化学发光成像分析仪(美国通用医疗有限公司)。

1.1.3 实验试剂 曲札茋苷注射剂由铂源药物研究有限公司提供;醋酸泼尼松片购自浙江仙琚制药股份有限公司;注射用盐酸多柔比星购自深圳万乐药业有限公司; IL-6试剂盒、IL-8试剂盒购自南京建成科技有限公司;Bradford蛋白定量试剂盒购自索莱宝生物科技有限公司;HMGB-1多克隆抗体购自Abcam生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组 健康成年雄性SD大鼠30只,随机分为5组:空白对照组、模型组、醋酸泼尼松组、5 mg·kg-1曲札茋苷组、10 mg·kg-1曲札茋苷组,每组6只。

1.2.2 实验造模及给药 通过单次尾静脉注射Dox溶液(6.5～7.5 mg·kg-1,溶于0.9 % NaCl溶液),空白对照组注射等体积的0.9% NaCl溶液,造模当日记为实验第1天,实验第7天开始给予药物治疗。(1)空白对照组:给予等体积0.5% 羧甲基纤维素钠水溶液灌胃及0.9% NaCl溶液尾静脉注射;(2)模型组:给予等体积0.5%羧甲基纤维素钠水溶液灌胃及0.9% NaCl溶液尾静脉注射;(3)醋酸泼尼松组:给予0.5% 羧甲基纤维素钠水溶液配制醋酸泼尼松溶液,按照10 mg·kg-1的剂量灌胃及0.9% NaCl溶液尾静脉注射;(4)5 mg·kg-1曲札茋苷组:给予体积0.5% 羧甲基纤维素钠水溶液灌胃及0.9% NaCl溶液配制的曲札茋苷溶液,按照5 mg·kg-1的剂量尾静脉注射;(5)10 mg·kg-1曲札茋苷组:给予等体积0.5% 羧甲基纤维素钠水溶液灌胃及0.9% NaCl溶液配制的曲札茋苷溶液,按照10 mg·kg-1的剂量尾静脉注射。

1.3 检测指标

1.3.1 24 h尿蛋白含量 实验期间,收集第3、7、14、21、28天的24 h尿液,收集尿液时,给予足够饮水并且禁食,收集尿液后在1000×g的离心力的条件下离心20 min,取其上清液进行尿蛋白定量,尿蛋白定量时使用Bradford蛋白定量试剂盒,操作时严格按照试剂盒使用说明进行,按照试剂盒说明书要求计算蛋白含量。

1.3.2 血液生化指标 实验第29天,取大鼠腹主动脉血液,静置30 min,在1000×g的条件下离心15 min,取上清液,用全自动血生化检测仪测取血清总蛋白,血清白蛋白,甘油三酯,总胆固醇,尿素氮,肌酐。

1.3.3 曲札茋苷对NS大鼠肾组织超微结构的影响 实验第29天,取大鼠双侧肾脏,取肾皮质固定于2.5%戊二醛溶液中,经过PBS清洗,1%锇酸固定、以及梯度脱水等过程后,进行包埋,再升温聚合,切片染色后观察。

1.3.4 HMGB-1、Desmin、Nephrin蛋白含量测定 实验结束时,摘取大鼠右侧肾脏,取20 mg肾皮质组织,加入250 μL组织裂解液,剪碎,然后匀浆并离心。取上清液,进行蛋白定量,加入5倍上样缓冲液,加热变性后待用。

1.3.5 曲札茋苷对血清IL-6和IL-8含量的影响 手术取材后,取每只大鼠腹主动脉血,静置,离心,取血清,按照IL-6和IL-8定量试剂盒说明书操作,最后根据说明书要求计算血清中IL-6和IL-8含量。

1.4 统计学方法

2 实验结果

2.1 曲札茋苷对NS大鼠24 h尿蛋白含量的影响

如表1所示,注射Dox造模后,静脉注射阿霉素后,大鼠尿蛋白排泄量逐渐增加。第7天时,模型对照组大鼠尿蛋白含量显著高于正常对照组;第14天开始,模型对照组大鼠尿蛋白含量快速升高。醋酸泼尼松治疗显著降低大鼠第14、21和28天尿蛋白含量;5 mg·kg-1曲札茋苷在第14～21天治疗效果相比于醋酸泼尼松的治疗效果较差,第28天时治疗效果优于醋酸泼尼松;10 mg·kg-1曲札茋苷组第14、21、28天的治疗效果较优于醋酸泼尼松组。

表1 曲札茋苷对各个时间24 h尿蛋白的影响

2.2 曲札茋苷对NS大鼠血液生化指标的影响

如表2所示,模型组与空白对照组相比大鼠血清白蛋白和总蛋白含量下降,同时升高胆固醇和甘油三酯水平。醋酸泼尼松治疗后血清白蛋白和总蛋白含量升高,降低了胆固醇和甘油三酯水平;与模型组相比,5 mg·kg-1和 10 mg·kg-1曲札茋苷组可以升高血清白蛋白和总蛋白含量,降低胆固醇和甘油三酯水平。5 mg·kg-1曲札茋苷组和醋酸泼尼松对血液生化指标的改善作用相差不大,差异不具有统计学意义;10 mg·kg-1曲札茋苷对各项血液生化指标的改善效果较为显著。这些数据表明,曲札茋苷对于NS的症状有着良好的治疗作用。

表2 曲札茋苷对血生化指标的影响

2.3 曲札茋苷对NS大鼠肾功能的影响

为了评价曲札茋苷对NS大鼠肾功能损伤的治疗程度影响,检测了血清中肌酐和尿素氮的含量，结果见表3。模型组与空白对照组相比,模型组大鼠血清中的肌酐和尿素氮含量明显升高;醋酸泼尼松治疗后,血清中肌酐和尿素氮含量降低;5 mg·kg-1曲札茋苷组和10 mg·kg-1曲札茋苷组可以降低肌酐和尿素氮含量,且10 mg·kg-1曲札茋苷组治疗效果优于醋酸泼尼松组。

表3 曲札茋苷对肾功能的影响

2.4 曲札茋苷对NS大鼠肾组织超微结构的影响

为了评价曲札茋苷对NS大鼠肾组织超微结构的影响,利用透射电镜观察肾皮质组织切片,结果见图2。空白对照组肾皮质足细胞足突明显,足突形状正常;突触间隙清晰可见。与空白对照组相比,模型组肾皮质足细胞足突广泛融合,突触间隙消失。醋酸泼尼松组改善足突融合现象,突触间隙略为清晰。5 mg·kg-1曲札茋苷组和10 mg·kg-1组曲札茋苷对肾皮质足细胞足突形状和突出间隙,10 mg·kg-1曲札茋苷组改善效果更明显。

图2 曲札茋苷对肾组织超微结构的影响(标尺=1.0 μm)

2.5 曲札茋苷对HMGB1、Desmin、Nephrin的表达的影响

如图3所示,模型组大鼠与空白对照组相比,HMGB1和Desmin表达水平增高,Nephrin表达水平降低。醋酸泼尼松干预后,HMGB1和Desmin表达水平降低,Nephrin表达水平增高。5 mg·kg-1和10 mg·kg-1曲札茋苷干预后,HMGB1和Desmin表达水平均有降低,Nephrin表达水平升高,且10 mg·kg-1曲札茋苷组对HMGB1、Desmin和Nephrin的表达水平改善效果较好。

与空白对照组相比,#P<0.05,##P<0.01；与模型组对比,*P<0.05,**P<0.01；与醋酸泼尼松组相比,&P<0.05,&&P<0.01。

2.6 曲札茋苷对血清IL-6和IL-8含量的影响

为了评价曲札茋苷对于NS大鼠炎症因子的影响,检测了血清中炎症因子IL-6和IL-8的含量结果见表4。与空白对照组相比,模型组血清中IL-6和IL-8含量明显升高,提示NS大鼠中有炎症发生。醋酸泼尼松治疗后,IL-6和IL-8含量下降。5 mg·kg-1曲札茋苷组和10 mg·kg-1组曲札茋苷对血清中IL-6和IL-8含量降低作用,且10 mg·kg-1曲札茋苷组治疗效果较好。说明曲札茋苷能有效改善NS大鼠血清中炎症因子,具有良好的抗炎作用。

表4 曲札茋苷对血清IL-6、IL-8的影响

3 讨 论

注射用盐酸多柔比星诱导的NS大鼠模型是最为常用的实验性肾病模型之一[16]。在本实验中,通过尾静脉注射7.5 mg·kg-1Dox进行造模,在造模7 d后,NS大鼠的24 h尿蛋白含量随着时间增加而升高,实验结束时,模型组24 h尿蛋白含量已明显高于正常组;血清总蛋白和血清白蛋白含量低于正常组;甘油三酯和血清总胆固醇含量高于正常组。与此同时,尿素氮和血肌酐升高,肾功能受损。透射电镜下观察,肾足细胞足突广泛融合,突触间隙消失,这些特征符合NS的临床特征和病理表现[17-18]。这说明:本次实验中所诱导的NS大鼠模型,可以用来研究曲札茋苷对NS的治疗作用。

本实验结果表明,醋酸泼尼松对NS大鼠有良好的治疗作用,而10 mg·kg-1曲札茋苷对于NS大鼠的各种症状具有更好的缓解作用,可以更显著地减缓Dox导致的肾功能损伤。应用曲札茋苷治疗后,NS大鼠的蛋白尿得到了有效缓解。在NS中,蛋白尿是最主要的症状,也是促进NS病理进程的重要原因。蛋白尿产生过程中,肾小球滤过功能紊乱是重要原因[19],本实验中,Dox诱导的NS大鼠肾组织在透射电镜下肾小球基底膜(Glomerular basement membrane,GBM)形态基本正常,但是足突广泛融合,突触间隙消失;血清中尿素氮和肌酐含量较高,这可能是肾小球足细胞裂孔(Slit diaphragm,SD)蛋白分子Nephrin受损表达降低[20],从而导致SD结构遭到破坏,使肾小球滤过功能严重失调;并且肾小球损伤的标志性蛋白分子Desmin表达升高提示了蛋白尿的产生可能与肾小球损伤密切相关[21]。在曲札茋苷治疗后,Nephrin表达上升,Desmin表达下降,同时透射电镜下的病理现象明显改善。

NS的发病机制复杂,炎症反应已经被证明为发病的重要原因[3],在NS病理进程中,炎症蛋白HMGB1异常表达,从而激活炎症反应,产生IL-6、IL-8等炎症因子[22],加重肾功能损伤。本研究表明,NS大鼠与空白对照组相比,IL-6和IL-8含量明显升高,这表明NS大鼠处于炎症状态。与模型组相比,10 mg·kg-1曲札茋苷能显著降低NS大鼠血清中的IL-6和IL-8水平,表明曲札茋苷可以通过改善NS大鼠的炎症反应进而缓解NS。

4 结 论

综上所述,曲札茋苷在治疗NS大鼠中具有显著疗效。当给予NS大鼠10 mg·kg-1曲札茋苷时,对NS的治疗效果稍优于醋酸泼尼松,并对HMGB1的表达有下调作用,并下调炎症因子IL-6和IL-8,这说明曲札茋苷可能通过抑制炎症反应治疗NS。本实验结果预示着曲札茋苷有着良好的开发前景,同时也为曲札茋苷的药物研发和临床上治疗NS的应用提供了实验依据。