定量检测PAX1 甲基化诊断宫颈癌前病变的应用分析

卡米拉·库来西江 朱敏 姜敏 马玉花 梁飞 来依宁 高静

宫颈癌属于一种常见的女性生殖器官恶性肿瘤,近年来的发病率明显提高,严重危害了女性身体健康［1］。宫颈癌形成的重要原因之一为HPV 反复、持续感染,相关研究显示,PAX1 基因甲基化表达异常升高可在不同层次、阶段对癌前病变病理进程产生影响,和宫颈癌发生、发展存在密切相关性［2］。鉴于此,本研究分别对正常宫颈患者、低级别病变患者、高级别病变患者、癌变患者的宫颈刮片、组织标本进行收集,采用焦磷酸测序技术与反转录聚合酶链反应(RT-PCR)对PAX1 基因甲基化行定量检测,分析宫颈癌前病变诊断中PAX1 甲基化定量检测的应用价值,并将本院136 例高危亚型HPV 患者作为研究对象,以期能获得理想的研究结果,报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018 年12 月～2020 年4 月在本院诊治的136 例高危型HPV 感染患者为研究对象,以病理结果为依据分为四组,即甲组(正常宫颈,28 例)、乙组(低级别病变,32 例)、丙组(高级别病变,33 例)、丁组(癌变,43 例)。甲组患者,年龄32～55 岁,平均年龄(40.12±5.25)岁；乙组患者,年龄31～54 岁,平均年龄(40.09±4.83)岁；丙组患者,年龄32～56 岁,平均年龄(40.28±5.31)岁；丁组患者,年龄32～54 岁,平均年龄(40.08±4.79)岁。四组患者的一般资料比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2 纳入及排除标准

1.2.1 纳入标准 ①患者知情同意；②精神、认知功能正常；③经医学伦理委员会批准。

1.2.2 排除标准 ①中途退出；②存在造血系统疾病；③存在免疫系统疾病；④妊娠者；⑤存在妇科良性或者恶性肿瘤病史。

1.3 方法

1.3.1 标本采集方法 指导所有患者取截石位,行常规消毒处理,获取少量病变部位细胞之后,将其制作成为宫颈刮片,在阴道镜下获取宫颈组织行活检,同时所有患者均接受HPV 检查,获取标本后保存于4℃温度下,待用。

1.3.2 DNA 提取、扩增与修饰 采用Omniscript RT试剂盒(德国Qiagen 公司生产)对DNA 进行提取,并采用亚硫酸氢盐进行处理,然后再行PAX1 基因转录,基因外侧下游、上游引物分别为：5'-ACCCA GCTCATCCACACTCCC-3'、5'-AAGTTGATTT AGGGTTTGGGGT-3'；PAX1基因下游、上游引物分别为：5'-AAATACCCRAGACTAAACGC-3'、5'-GTGGAGACTGTGTCGGGAGGG-3'。

1.3.3 基因测序 采用焦磷酸测序技术行PAX1 基因甲基化定量检测,首先需合理配置混合液,包括荧光素酶14.6 mg/L、Klenow DNA 聚合酶18×10-3U/L、三磷酸腺苷双磷酸酶2×10-3U/L、三磷酸腺苷硫酸化酶2×10-4U/L、D-虫荧光素0.4 mmol/L、聚乙烯吡咯烷(PVP)0.4 μg/L、5’磷酸化硫酸腺苷(APS)3 μmol/L、二硫苏糖醇(DTT)1 mmol/L、0.1%牛血清蛋白(BSA)、乙二胺四乙酸(EDTA)2 mmol/L、氨丁三醇(TAM)缓冲液0.1 mol/L。制作完成之后对样本中PAX1 基因甲基化程度行定量测定,每份样本甲基化程度为9 位点甲基化程度的平均值。

1.4 观察指标 ①对比四组患者病变组织中的PAX1基因甲基化发生率、HPV 阳性率；②对比四组宫颈组织与宫颈刮片中的PAX1 基因甲基化水平；③通过ROC 曲线分析PAX1 基因甲基化诊断高、低级别癌前病变、正常宫颈的有效性。

1.5 统计学方法 采用SPSS20.0 统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差()表示,采用t 检验；计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 四组PAX1 基因甲基化发生率、HPV 阳性率比较 甲组PAX1 基因甲基化患者0 例,发生率为0；乙组PAX1 基因甲基化患者2 例,发生率为6.25%；丙组PAX1 基因甲基化患者15 例,发生率为45.45%；丁组PAX1 基因甲基化患者43 例,发生率为100.00%。甲、乙、丙、丁四组患者的PAX1 基因甲基化发生率逐渐提高,比较差异具有统计学意义(P<0.05)。甲组HPV阳性患者9 例,阳性率为32.14%；乙组HPV 阳性患者26 例,阳性率为81.25%；丙组HPV 阳性患者30 例,阳性率为90.91%；丁组HPV 阳性患者40 例,阳性率为93.02%。甲、乙、丙、丁四组患者的HPV 阳性率逐渐提高,比较差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.2 四组宫颈组织与宫颈刮片中的PAX1 基因甲基化水平比较 丁组患者宫颈组织、宫颈刮片中的PAX1基因甲基化水平均高于甲组、乙组、丙组,丙组高于甲组、乙组,乙组高于甲组,差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 四组宫颈组织与宫颈刮片中的PAX1 基因甲基化水平比较(,%)

表1 四组宫颈组织与宫颈刮片中的PAX1 基因甲基化水平比较(,%)

注：与甲组比较,aP<0.05；与乙组比较,bP<0.05；与丙组比较,cP<0.05

2.3 ROC 曲线分析 通过绘制ROC 曲线得知,PAX1基因甲基化诊断高、低级别癌前病变、正常宫颈的ROC 曲线下面积为0.88,采用PAX1 基因甲基化水平诊断高级别宫颈癌前病变可知,最佳阈值为4.15%,此时特异度为79.15%,灵敏度为89.39%。见图1。

图1 ROC 曲线分析

3 讨论

研究显示,从宫颈癌前病变发展成为宫颈癌需要较长时间,宫颈癌患者发病早期通常不会出现明显临床症状,等到有明显临床症状出现时,通常已经处于中晚期［3］。以往临床多数研究显示,宫颈癌前病变过程涉及多种基因改变,其中以DNA 甲基化为重要代表的表观遗传学改变尤为重要［4］。近年来的临床研究显示,PAX1 基因甲基化水平在宫颈癌组织中出现异常增高现象［5］。有学者针对我国台湾地区进行分析,研究结果显示宫颈癌患者PAX1 基因甲基化发生率高达89%,为此,临床可尝试将PAX1 基因甲基化水平作为早期诊断宫颈癌的一个重要标志物［6］。但临床多数研究均认为,对PAX1 基因甲基化水平行定性分析难以量化判断甲基化程度,只能用来诊断浸润癌。大部分宫颈癌出现的原因为HPV 病毒反复、持续感染,因现阶段临床研究显示低级别宫颈癌前病变发展为浸润癌的可能性较低,所以为了降低宫颈癌发生率,需对高级别宫颈癌前病变进行及早筛查。

现阶段,随着细胞学检查技术、HPV 病毒微量提取等各种技术被广泛应用于临床,多数早期浸润性宫颈癌、宫颈癌前病变患者已经获得及时诊治。研究显示,HPV 感染最终并不一定会发展成为宫颈癌或者癌前病变,这也就说明可能有其他协同因子在宫颈癌发生、发展过程中发挥作用。临床多数研究显示,癌基因异常表达会对肿瘤发生、发展产生多方面影响,例如调控细胞分裂与细胞增殖过程等,同时抑癌基因异常甲基化也会对抑癌基因表达进行抑制［7］。宫颈癌组织中PAX1 基因甲基化水平异常升高,并且可在宫颈癌脱落细胞中检测到PAX1 基因甲基化。国外学者经研究发现［8］,宫颈癌早期诊断过程中,可将PAX1 基因甲基化水平作为重要辅助诊断方式之一,该诊断方式区分正常组织、宫颈上皮内瘤变(CIN)2 的特异度为92%,灵敏度为66%。虽然临床关于宫颈癌患者PAX1基因甲基化水平的研究较多,但关于患病类型的鉴别区分却较为少见。本研究采用定量分析方式对正常宫颈患者、低级别病变患者、高级别病变患者、癌变患者的PAX1 基因甲基化水平进行测定,结果显示,甲组PAX1 基因甲基化发生率为0,乙组为6.25%,丙组为45.45%,丁组为100.00%,甲、乙、丙、丁四组患者的PAX1 基因甲基化发生率逐渐提高,比较差异具有统计学意义(P<0.05)。丁组患者宫颈组织、宫颈刮片中的PAX1 基因甲基化水平均高于甲组、乙组、丙组,丙组高于甲组、乙组,乙组高于甲组,差异具有统计学意义(P<0.05)。提示通过定量检测PAX1 基因甲基化水平,可在一定程度上筛选宫颈癌高危人群,进而为之后的随访观察提供重要依据。焦磷酸测序技术属于新型DNA 序列分析方式之一,无需行荧光标记与电泳,可对多个甲基化位点进行同时检测,进而获取精准的定量PAX1 基因甲基化测定值。该分析方式不仅可以用来定量检测甲基化程度,同时还具备高准确性与可重复性,相较于其他高通量测序技术,该分析方式的检测成本也相对更低。本研究通过绘制ROC 曲线得知,PAX1 基因甲基化诊断高、低级别癌前病变、正常宫颈的ROC 曲线下面积为0.88,同时经初步研究分析得知,最佳阈值为4.15%时,PAX1 基因甲基化水平诊断高级别宫颈癌前病变的特异度为79.15%,灵敏度为89.39%,提示临床可将PAX1 基因甲基化水平作为早期宫颈癌诊断的重要辅助方式之一。

综上所述,宫颈癌前病变诊断中PAX1 甲基化定量检测具有一定应用价值,可对高级别宫颈癌前病变进行有效鉴别。