NRG1及其受体ErbB4在大鼠不同发育阶段不同脑区表达及与抑郁认知功能关系研究

彭小健，刘海洋，张红星

(1.商洛市中心医院神经外科,陕西 商洛 726000；2.商洛市中心医院CT室,陕西 商洛 726000；3.西北大学附属西安高新医院神经内三科,陕西 西安 710075)

抑郁症作为精神科常见疾病，患者常见情绪低落、兴趣减退，严重者可出现自杀观念和行为，极大的危害了人类健康，造成严重的经济和社会负担[1-3]。近年来大量研究表明，抑郁患者常伴有一定程度的认知功能损伤，学习、记忆能力、抽象思维、反应速度等临床表现，且随着抑郁症病程的进展而加剧，严重影响患者的远期预后和生活质量[4-5]。

神经调节蛋白1(Neuroregulin 1，NRG1)及其受体ErbB4作为抑郁症的易感基因，在抑郁动物模型大脑组织中高表达[6-8]。Ada等[9]研究认为，NRG1和ErbB4在维持神经环路平衡、神经元发育、突触的发育及其功能维持、神经递质的传递等过程中均发挥着关键作用。动物研究表明，脆弱X综合征(FXS)小鼠智力缺陷以及学习功能障碍可能与其ErbB4表达下调影响了小鼠大脑皮质小清蛋白(PV)阳性中间神经元数量减少有关，初步认为ErbB4参与了FXS小鼠的发病过程[10]。但关于NRG1/ErbB4在不同发育阶段、不同脑区抑郁大鼠中的变化目前研究仍较少。因此，本文探讨了NRG1/ErbB4在不同发育阶段抑郁大鼠不同脑区中的表达及其与认知功能障碍的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康清洁级SD大鼠60只，体重(150±50)g，购自于北京维通利华有限责任公司，于实验中心进行繁殖，常规喂养1周后进行实验。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组及大鼠急性应激抑郁模型的建立：取新生鼠(出生后15 d)、幼年鼠(出生后30 d)和成年鼠(90 d)各20只，组内随机分为对照组和模型组，各10只。采用慢性不可预见性轻度应激方法(CUMS)建立大鼠抑郁模型，从实验第1天至第21天，模型组每天接受一种应激刺激，包括足底电击、夹尾、禁水、禁食、冰水游泳、昼夜颠倒等。空白对照组不做任何处理。

1.2.2 旷场实验(OFT)：应用旷场实验进行大鼠自主活动评分：将大鼠置于敞箱装置中心格内，其中敞箱装置(75 cm ×75 cm ×40 cm)为透明材料制成，底面被等分为25个方格，没有顶盖。实验进行时，保持周围环境安静，观察并记录大鼠5 min内水平运动得分(四爪进入方格次数)及垂直运动得分(前爪腾空或攀附墙壁次数)。彻底清洁敞箱后再进行下一只大鼠的观察。

1.2.3 水迷宫实验：采用Morris水迷宫定向航行测试(PNT)和空间探索测试(SPT)评价各组大鼠学习和记忆能力。定位航行测试：训练连续进行5 d，每天进行4轮训练(每个入水点各1次)，每次2 min，训练间隔大于30 min，记录大鼠在水迷宫内寻找平台的时间。将大鼠面向池壁分别于4个入水点放入水中，记录大鼠从入水到找到平台并站立其上的时间(逃避潜伏期)和在此期间的游泳活动轨迹(即游泳距离)。空间探索测试：定位导航测试结束后第2天测试大鼠的空间位置记忆能力，具体如下，移去水下平台，选择距离平台最远的入水点将大鼠放入水池中，记录其在120 s内跨过原平台所在位置的次数。

1.2.4 RT-PCR法检测各组大鼠海马及前额皮层组织中NRG1、ErbB4基因的表达：采用聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测NRG1、ErbB4基因表达水平。预变性，变性，退火，延伸，循环，延伸。同时上样扩增产物和Maker，电泳，银染，紫外凝胶成像系统分析结果并拍照。

2 结 果

2.1 各组大鼠体重变化情况比较 见表1。与同龄对照组比较，新生、幼年以及成年模型组大鼠在建模10 d及21 d时体重明显下降(均P<0.05)。

表1 各组大鼠体重变化情况比较(g)

2.2 各组大鼠自主行为评分比较 见表2。与同龄对照组比较，新生模型组与幼年模型组大鼠水平运动和垂直运动得分显著降低(均P<0.05)。与同龄对照组比较，成年模型组大鼠水平运动和垂直运动得分无明显变化(均P>0.05)。与新生模型组比较，幼年及成年模型组大鼠水平运动和垂直运动得分显著增加，成年模型组高于幼年模型组(均P<0.05)。

表2 各组大鼠自主行为评分比较(分)

2.3 各组大鼠学习及记忆能力情况比较 见表3。与同龄对照组比较，新生模型组和幼年模型组大鼠逃避潜伏期和游泳距离显著增加，穿越平台次数显著降低(均P<0.05)。与同龄对照组比较，成年模型组逃避潜伏期、游泳距离以及穿越平台次数无明显变化(均P>0.05)。与新生模型组比较，幼年及成年模型组大鼠逃避潜伏期和游泳距离显著降低，幼年模型组高于成年模型组，穿越平台次数显著增加，幼年模型组低于成年模型组(均P<0.05)。

表3 各组大鼠学习及记忆能力情况比较

2.4 各组大鼠海马、前额皮层组织中NRG1、ErbB4基因表达水平比较 NRG1、ErbB4以及GAPDH引物设计见表4。各组大鼠海马、前额皮层组织中NRG1、ErbB4基因表达水平情况见表5(图1)。与同龄对照组比较，新生和幼年模型组大鼠海马及前额皮层组织中NRG1、ErbB4表达水平显著升高(均P<0.05)。与同龄对照组比较，成年组大鼠海马及前额皮层组织中NRG1及 ErbB4表达水平无明显变化(P>0.05)。与新生模型组比较，幼年及成年模型组大鼠新生和幼年模型组大鼠海马及前额皮层组织中NRG1、ErbB4表达水平显著降低，幼年模型组低于成年模型组(均P<0.05)。各模型组中海马及前额皮层组织中NRG1、ErbB4表达水平比较无统计学差异(均P>0.05)。

表4 引物序列设计

表5 各组大鼠海马、前额皮层组织中NRG1、ErbB4基因表达水平比较

图1 各组大鼠海马、前额皮层组织中

3 讨 论

研究[11]表明，抑郁症患者认知功能损伤呈典型的年龄相关性，对脑发育早期(新生儿期及婴幼儿期)患者认知功能的损害更为突出。NRG1是一种ErbB受体酪氨酸激酶的营养因子，可与微清蛋白中间神经元高亲和力受体ErbB4结合并激活一系列胞内信号通路[12-13]。研究表明[14-16]，NRG1-ErbB4信号通路在中枢神经系统的发育过程中发挥着重要的作用，现已被大量学者鉴定为抑郁症的易感基因。与成人相比，婴幼儿处于大脑发展的黄金时期，其对外界刺激更为敏感。目前关于不同发育阶段抑郁对大鼠认知功能影响的报道较少，其作用机制也不太清楚。鉴于此，本研究取新生鼠(出生后15 d)、幼年鼠(出生后30 d)和成年鼠(出生后90 d)各20只，组内随机分为对照组和模型组各10只，采用慢性不可预见性轻度应激(CUMS)建立大鼠抑郁模型。

研究结果显示，新生、幼年以及成年模型组大鼠在建模10 d及21 d时体重增长较同龄对照组明显落后，初步证明CUMS大鼠抑郁模型建立成功，提示抑郁情绪可造成大鼠体重下降。旷场实验结果显示，与同龄对照组相比，新生模型组与幼年模型组大鼠水平运动和垂直运动得分均显著降低。与新生模型组相比，幼年及成年模型组大鼠水平运动和垂直运动得分均显著增加，成年模型组高于幼年模型组。Morris水迷宫测试表明，与同龄对照组相比，新生模型组和幼年模型组大鼠逃避潜伏期和游泳距离显著增加，穿越平台次数显著降低。与新生模型组相比，幼年及成年模型组大鼠逃避潜伏期和游泳距离显著降低，幼年模型组高于成年模型组，穿越平台次数显著增加，幼年模型组低于成年模型组。旷场实验和水迷宫实验结果表明抑郁情绪对不同发育阶段的大鼠学习及记忆能力影响程度不同，新生及幼年大鼠对抑郁情绪更加敏感，可显著降低大鼠的自主活动、学习和记忆能力。我们采用RT-PCR法检测各组大鼠海马以及前额皮层组织中NRG1、ErbB4基因表达水平的变化。海马及前额皮层在抑郁症等情感障碍中发挥重要作用，是研究抑郁相关研究常涉及到的脑区[17-19]，故本研究选取大鼠海马及前额皮层作为生化指标检测区域。与同龄对照组相比，新生和幼年模型组大鼠海马及前额皮层组织中NRG1、ErbB4表达水平显著升高。与新生模型组相比，幼年及成年模型组大鼠新生和幼年模型组大鼠海马及前额皮层组织中NRG1、ErbB4表达水平显著降低，幼年模型组低于成年模型组。各模型组中海马及前额皮层中NRG1、ErbB4表达水平比较无统计学差异。说明抑郁大鼠海马及前额皮层组织中NRG1、 ErbB4高表达，且其水平与年龄可能与年龄有关，年龄越小，海马及前额皮层组织中NRG1、 ErbB4越高。由此推测，尽管影响认知功能的因素有很多，抑郁可通过影响为不同发育阶段大鼠海马组织及前额皮层中NRG1、 ErbB4的表达，导致其学习及记忆能力的下降。

综上所述，抑郁可影响SD大鼠认知功能，降低其学习及记忆能力，脑发育早期抑郁对认知功能的损害更为明显，海马区及前额皮层组织中NRG1、ErbB4的高表达可能是抑郁影响大鼠认知、学习和记忆功能的机制之一。