小柄马勃液体发酵产物对大鼠四氯化碳型肝损伤的治疗作用*

步洪石，杨秀璐，王淑敏

（长春中医药大学，吉林 长春 130117）

肝损伤是由物理、化学、病毒感染以及自身免疫疾病等多种因素导致的肝脏器质性损害，如不及时治疗还会引起肝硬化、肝纤维化或者肝癌等[1]。目前肝损伤的治疗手段主要集中于抗氧化或减缓炎症反应等方面[1－4]，而传统的中草药或膳食补剂恰恰是药物性肝损伤的主要成因[5]，治疗效果与肝毒副作用处于并存的两难境地，寻找具有确切养肝功效、减缓肝损伤进程的活性物质十分必要。

小柄马勃（Lycoperdon pedicellatus） 是马勃科（Lvcoperdaceae）、马勃属 （Lycoperdon Tourn．ex Pers．）的一种药用真菌，其子实体具有止血、抗溃疡、抗炎等诸多药理作用[6]。课题组前期研究发现，小柄马勃发酵物可以改善香烟诱导的慢性阻塞性肺病小鼠体内的氧化应激反应，显著抑制炎症因子的生成[7]，具有良好的抗炎及抗氧化作用。故拟采用小柄马勃发酵产物探究其对四氯化碳导致肝损伤模型的保护作用及机制，以期为相关疾病治疗药物的开发提供一定的试验依据与理论参考。

1 试验材料

1.1 试验药品与试剂

水飞蓟宾（批号：181114），郑州荔诺生物科技有限公司；生理盐水，上海现代哈森（商丘）药业有限公司；乙醇，北京化工厂；小柄马勃液体发酵菌丝与发酵液，由长春中医药大学生物工程实验室自制；谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、肿瘤坏死因子－α （tumor necrosis factor－α，TNF－α）、白细胞介素－1β （interleukin－1β，IL－1β）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD） 活性、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、透明质酸 （hyaluronic acid，HA） 试剂盒（批号：E20171201A），上海源叶生物科技有限公司；欧丽薇兰橄榄油，嘉里粮油（天津）有限公司。

1.2 试验动物

健康雄性封闭群（sprague－dawley，SD） 大鼠63只 （180 g～210 g），无特定病原体 SPF（specific pathogen free，SPF） 级别，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供。动物合格证号：SCXK（辽）2015－0001；合格证编号：NO．211002300024233。

1.3 试验仪器

ADVIA 2400全自动生化分析仪，西门子公司；FA25组织匀浆机，上海福鲁克流体机械制造有限公司；Rayto RT－6000酶标仪，深圳雷杜生命科学股份有限公司；Olympus生物显微镜，上海普赫光电科技有限公司；TGL16M台式高速冷冻离心机，湖南凯达科学仪器有限公司；AUY220万分之一分析天平，岛津国际贸易上海有限公司。

2 试验方法

2.1 给药与分组

将63只SD大鼠，随机分为7组。分别是：空白组（不造模，灌胃生理盐水）；模型组（造模，灌胃生理盐水）；阳性药组（造模，灌胃水飞蓟宾41．1 mg·kg－1，1 次/d）；小柄马勃液体发酵菌丝醇提组（灌胃，低剂量 1 g·kg－1、高剂量 2 g·kg－1，1 次/d）；小柄马勃发酵液组（灌胃，低剂量1 g·kg－1、高剂量2 g·kg－1，1 次/d）。

2.2 造模方法

通过磁力搅拌器将比例为1∶1的橄榄油与四氯化碳（3 mg·mL－1）均匀混合，每周皮下注射2次，连续给药8周（第6周检测谷丙转氨酶/谷草转氨酶指标，观察造模是否成功），确定造模成功，各治疗组分别给予相应治疗药物，每日1次，至第8周末。末次给药禁食、不禁水10 h，采用10%水合氯醛0．3 mL·kg－1进行动物麻醉，腹主动脉取血、取肝脏，血液静置 90 min 以上，3 500 r·min－1、4℃离心 10 min，移液枪吸取上清液置于1．5 mL EP管中备用，按照相应试剂盒说明检测AST、ALT、IL－1β、TNF－α、HA含量；肝组织称重，加入9倍量生理盐水，充分匀浆后，同样 3 500 r·min－1、4℃离心 10 min，移液枪吸取上清液置于1．5 mL EP管中4℃冷藏，按照相应试剂盒说明检测SOD、MDA指标。

2.3 肝组织病理学检验

分离部分肝脏，置于50 mL EP管中，以4%多聚甲醛充分固定，制备石蜡切片，苏木精－伊红（hematoxylin－eosin staining，H．E） 染色后，于光学显微镜下观察病理学变化。

2.4 统计学处理

3 结果分析

3.1 血清中ALT、AST含量检测结果

小柄马勃对血清中ALT、AST含量的影响见表1。

表1 小柄马勃对血清中ALT、AST含量的影响Tab．1 The effect of Lycoperdon pedicellatus on the content of ALT and AST in serum

由表1显示，模型组较空白组ALT、AST含量显著升高，具有极显著差异（P<0．001），证明造模成功。阳性药组、小柄马勃治疗组较模型组ALT、AST 含量显著降低 （P<0．05、P<0．001），小柄马勃醇提高剂量组对于AST的降低效果最佳，发酵液高剂量组对于ALT的降低效果最佳。

3.2 血清中IL-1β、TNF-α含量检测结果

小柄马勃对血清中IL－1β、TNF－α含量的影响见表2。

表2 小柄马勃对血清中IL－1β、TNF－α含量的影响Tab．2 The effect of Lycoperdon pedicellatus on the content of IL－1β and TNF－α in serum

如表2所示，模型组与空白组比较IL－1β含量显著升高（P<0．001），TNF－α含量极显著升高（P<0．001），证明此造模方法能够导致大鼠体内炎症因子的升高，造成炎症反应。与阳性药组相比，小柄马勃发酵物对于IL－1β含量降低效果不明显。所有治疗组对降低TNF－α含量均有较好效果，且小柄马勃发酵产物各组的效果优于阳性药组，菌丝醇提高剂量组对于TNF－α的降低效果最佳。

3.3 血清中SOD、MDA及HA含量检测结果

小柄马勃对血清中SOD、MDA及HA含量的影响见表3。

如表3所示，模型组与空白组相比SOD含量显著降低（P<0．05），MDA及HA含量显著升高（P<0．05），证明此造模方法能够导致大鼠产生氧化应激反应。除小柄马勃发酵液低剂量组外，其余各治疗组均能显著升高肝组织中的SOD水平（P<0．05）。此外，各治疗组均能显著降低肝组织中MDA含量（P<0．001）。小柄马勃醇提低剂量、高剂量组与小柄马勃发酵液低剂量组均能显著降低HA水平（P<0．001）。

表3 小柄马勃对血清中SOD、MDA及HA含量的影响Tab．3 Effect of Lycoperdon pedicellatus on the content of SOD,MDA and HA in serum

3.4 肝组织病理学检验

肝损伤大鼠肝脏的光学显微镜镜检结果见图1。

由图1显示，空白组镜下可见肝小叶结构完整，肝细胞索排列整齐，以中央静脉为中心呈放射状排列。模型组肝小叶失去正常结构，肝细胞普遍变性，可见广泛的脂肪变性并有散在的嗜酸性变。治疗组大鼠肝小叶结构基本恢复正常，肝细胞索排列规则，与空白组相较，各组均有不同程度肝细胞脂肪变性，细胞轻度增生，与模型组比较，脂肪变性不明显。

图1 小柄马勃对肝损伤大鼠肝脏的病理影响（H.E，100×）Fig.1 Pathological effects of Lycoperdon pedicellatus on liver in rats with liver injury(H.E,100×)

4 讨论

目前试验性肝损伤模型主要包括化学性肝损伤、免疫性肝损伤和酒精性肝损伤，四氯化碳因其自身的溶酶作用和自由基代谢产物的产生可以导致化学性肝损伤，故研究选择了四氯化碳诱导化学性肝损伤经典动物模型[8]，以相应炎症因子及自由基评测指标 （ALT、AST、TNF－α、IL－1β、MDA、HA、SOD）的变化作为造模或治疗效果的衡量标准。ALT广泛存在于肝细胞中，一般与AST同时作为诊断肝脏疾病的重要参照，AST/ALT>1时，提示肝脏出现了实质性的损害，是急性肝细胞损害的敏感标志[9]。结果显示，模型组较空白组ALT、AST、TNF-α、IL-1β、MDA、HA含量显著增高，SOD含量显著降低，病理结果显示肝小叶结构异常，肝脏细胞变性等，说明化学性肝损伤模型建立成功，而小柄马勃治疗组可以不同程度地降低ALT、AST、TNF-α、MDA、HA的含量，升高SOD的含量，恢复细胞正常形态与功能，发挥肝损伤的治疗功效。

MDA是膜脂过氧化最重要的产物之一，其产生能够加剧膜脂损伤，因此可通过MDA了解膜脂过氧化的程度，以及细胞的损伤程度[10]；SOD是生物体内重要的抗氧化酶，是生物体内清除自由基的首要物质，可抵抗氧自由基对细胞造成的损害，同MDA一样，是评价肝损伤程度的关键指标[11]。研究结果发现，模型组与空白组相比SOD含量显著降低，而MDA含量显著升高，说明大鼠体内发生了氧化应激反应。与模型组相比，小柄马勃发酵产物能够显著降低大鼠体内MDA含量，小柄马勃发酵液低剂量组能显著提高SOD含量，其他各治疗组SOD皆有不同程度上升趋势，说明小柄马勃能够调节氧化应激反应，从而起到保护肝脏的作用。

由结果可以发现，该造模方法能够使大鼠体内IL-1β、TNF-α等促炎症因子含量显著性升高，说明此造模方法诱发了炎症反应，而小柄马勃发酵物组虽然并未显著降低IL-1β含量，但均能显著下调TNF-α含量，证明小柄马勃发酵物具有调节肝脏炎症反应的作用。HA由间质细胞合成，经淋巴系统分泌入血，HA的含量作为反映肝内皮细胞功能和肝纤维化进程的标志，其升高幅度与肝纤维化呈正相关[12]。与空白组相较，模型组HA含量显著升高，而相较模型组，小柄马勃治疗组能够显著下调HA含量，提升细胞的HA代谢能力，发挥保护肝细胞，缓解肝纤维化的作用。此外，由病理切片所显示的结果来看，四氯化碳能够诱发严重的肝细胞损伤与脂肪变性，而小柄马勃发酵物治疗组能够减少肝细胞的损伤，维持肝细胞结构，发挥预防和治疗肝损伤类疾病的作用。

综上所述，小柄马勃能够通过降低大鼠血清中ALT及AST的含量，调节肝组织中自由基含量与脂质过氧化程度，降低炎症反应，减缓肝细胞纤维化进程来维持肝脏正常的生理机能。目前肝脏类疾病以其较高的发病率与致死率成为医药学界亟待解决的关键问题，人群中肝炎、肝硬化、酒精肝、肝癌的患者比率逐年升高，小柄马勃预防和治疗肝损伤类疾病的研究对维持人类健康水平具有参考价值。