基于网络药理学探讨山药治疗2型糖尿病的有效成分及作用机制

杨丽宁 向蓉 王艺臻 张红梅

甘肃省第二人民医院，甘肃 兰州730000

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是一种常见的慢性代谢性疾病，其特点主要是血糖升高和代谢紊乱等，以及由此导致的全身组织、器官损害，严重危害人类的健康。山药是薯蓣科植物薯蓣（Dioscorea opposite Thunb.）的干燥根茎，其性平、气微、味淡、微酸，被列入我国传统的药食同源中药目录。中医理论认为，山药具有固肾涩精、补益脾胃、生津益肺之功效［1］。现代药理研究表明，山药具有调节血糖、保护胰岛功能、降血脂、增强免疫力等多种药理活性［2］。本研究通过网络药理学方法，挖掘山药治疗T2DM的主要成分及其作用靶点和通路，旨在为天然降血糖产品的研发提供理论依据。

1 方法

1.1 山药活性成分的获取和筛选 通过TCMSP数据库检索山药的活性成分。以药物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）和类药性（drug-likeness，DL）为筛选条件，设定OB≥30%、DL≥0.18的成分为有效活性成分。

1.2 山药活性成分的作用靶点及T2DM作用靶点的获取 通过TCMSP数据库查询山药有效活性成分的作用靶点，利用UniProt数据库对活性成分靶基因的名称进行标准化处理。在GeneCards数据库中以“type 2 diabetes mellitus”为搜索词，查询T2DM相关的作用靶点。

1.3 山药治疗T2DM潜在靶点的获取 通过Venny2.1.0在线软件获得山药有效活性成分与T2DM共同作用靶点，将结果导入Cytoscape3.7.2软件，构建药物活性成分-共同靶点网络图，并对其进行网络拓扑结构分析。

1.4 蛋白质相互作用（PPI）网络分析 将共同靶点导入STRING平台，物种选择“Homo sapiens”，结合分值设定为0.9，构建山药治疗T2DM的PPI网络。将该网络数据导入Cytoscape3.7.2软件中进行拓扑结构分析，筛选出山药治疗T2DM的核心靶点。

1.5 生物通路富集分析 采用基因注释工具DAVID 6.8对PPI网络筛选出的关键靶点进行KEGG通路富集分析，预测山药治疗T2DM的分子机制。

2 结果

2.1 山药有效活性成分及作用靶点的获取 通过TCMSP数据库查询到71种山药已知成分，以OB≥30%，DL≥0.18为筛选条件，得到16个有效活性成分，144个作用靶点；经Uniprot数据库对靶基因的名称进行标准化处理，去除数据库中没有预测靶点的活性成分并排除重复后，最终得到12个化合物、72个靶点。见表1。

表1 山药的活性成分

2.2 山药治疗2型糖尿病潜在靶点的获取 通过检索GeneCards数据库获得T2DM靶点基因9948个，设定Score大于中位数的靶点为T2DM的潜在靶点，最终得到T2DM作用靶点1986个，与山药有效活性成分靶点取交集后，得到41个共同靶基因。见图1。

图1 山药—T2DM共同靶基因的韦恩图

2.3 “药物活性成分-共同靶点”网络图的构建 将41个交集靶点数据导入Cytoscape3.7.2软件，构建“药物活性成分-共同靶点”网络图。见图2。度值较高的化合物有薯蓣皂苷元（diosgenin）、海风藤酮（Kadsurenone）等，这些化合物可能是山药治疗T2DM的关键化合物。

图2 山药治疗T2DM的“药物活性成分-共同靶点”网络图

2.4 PPI网络的构建与分析 将得到的41个交集靶点导入STRING平台构建PPI网络图，选取最低相互作用阈值大于0.9的靶点，隐藏游离节点，将结果导入Cytoscape3.7.2软件，得到度值排名前20的靶点，见图3。进一步筛选PPI网络中自由度、介数、中心度数均大于平均数的核心靶点蛋白有：AKT1、NR3C1、RELA、NOS2、SAA1。推测这些靶点可能是山药治疗T2DM的关键靶点。见图4。

图3 度值排名前20的靶点

2.5 GO富集分析 将41个交集靶点导入DAVID 6.8数据库进行GO富集分析，得到具有显著意义的46个生物过程（P＜0.05，FDR＜0.05），其中属于BP的20个，主要包括肽基谷氨酸羧化（peptidyl-glutamic acid carboxylation）、一氧化氮生物合成过程的正调控（positive regulation of nitric oxide biosynthetic process）、对热的反应（response to heat）、细胞对缺氧的反应（cellular response to hypoxia）、对雌二醇的反应（response to estradiol）等。属于CC的6个，包括突触后、小窝、蛋白质复合物、细胞表面、质膜、胞质溶胶。属于MF的20个，主要包括转录激活子活性，RNA聚合酶Ⅱ核心启动子近端区域序列特异性结合、酶结合、血红素结合、类固醇激素受体活性、类固醇结合等。结果如图5所示。

图5 共同靶点的GO富集分析图

2.6 KEGG通路富集分析 KEGG富集分析结果显示，具有显著意义的通路共21条（P＜0.05，FDR＜0.05），其中与T2DM相关度较高的通路主要包括肿瘤、炎症、胰岛素抵抗等。见图6。

图6 KEGG富集分析气泡图

3 讨论

本研究通过网络药理学方法分析探讨山药治疗T2DM的分子机制。通过TCMSP数据库筛选出12个山药有效活性成分，对应72个靶点，与T2DM作用靶点进行维恩分析，得到41个共同靶点，通过构建“药物活性成分-共同靶点”网络图，预测山药的关键活性成分可能为薯蓣皂苷元、海风藤酮等。薯蓣皂苷元是一种具有非常高生物活性的天然甾体皂甙元，其治疗糖尿病及其并发症的研究已被广泛报道。研究表明，薯蓣皂苷元可以改善葡萄糖耐量和血脂水平，减少IL-1β，IL-6和TNF-α的产生，还能有效调节细胞凋亡、炎症和氧化应激的相关靶标和途径，从而改善糖尿病及其并发症［3-4］。海风藤酮是一种木脂素类化合物，具有较强拮抗血小板活化因子的活性、清除氧自由基、保护细胞膜免受活性氧自由基损伤等药理活性［5］。

根据PPI网络图分析可得，山药治疗T2DM的核心靶点主要为：AKT1、NR3C1、RELA、NOS2、SAA1。其中AKT1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，又称蛋白激酶B，可以调控胰岛素PI3K-AKT信号通路，从而调控葡萄糖和脂质代谢［6］。血清皮质酮和糖皮质激素受体基因（NR3C1）多态性与人类血糖异常相关［7］。RELA是体内重要的致炎因子，可调控细胞凋亡及炎症应答反应。诱导型一氧化氮合酶（NOS2）基因在T2DM易感性中起重要作用，其多态性被认为可能是糖尿病肾病的遗传危险因素［8］。血清淀粉样蛋白A（SAA）是一种急性期蛋白复合物，具有载脂蛋白特性，由几种丰富的同工型组成。研究表明，2型糖尿病初发或明显肾病患者SAA升高，且SAA与胆固醇转运蛋白，B类I清除剂受体（SR-BI）介导的胆固醇向血清外排有关［9］。GO功能富集分析显示，山药治疗T2DM涉及到肽基谷氨酸羧化、一氧化氮生物合成、对热的反应、对缺氧的反应等生物过程，有突触后、小窝、蛋白质复合物等细胞组分参与，可能通过结合酶、蛋白质、受体等物质发挥抗T2DM的作用。

KEGG信号通路富集分析发现，山药活性成分治疗T2DM的主要信号通路有：缺氧诱导因子1信号通路、癌症途径、调节脂肪细胞中的脂肪分解、血管内皮生长因子信号通路、PI3K-Akt信号通路和胰岛素抵抗，其中HIF-1信号通路是富集到的最显著的信号通路，该通路可能是山药治疗糖尿病的重要机制之一。HIF-1信号通路是机体低氧应激反应时的主要靶点。研究表明，抑制糖尿病小鼠HIF-1α的表达，能抑制RhoA/ROCK信号转导通路的激活，降低血清MDA表达、促进SOD的释放，从而降低糖尿病小鼠的血糖水平［10］。癌症途径主要与癌症疾病相关，与该通路相关的靶基因有11个，提示癌症可能与T2DM存在某些共同的靶基因。调节脂肪细胞中的脂肪分解、胰岛素抵抗这些通路都直接与糖脂代谢有关。VEGF是内皮细胞特异性蛋白质，具有强大的调控血管形成能力，在糖尿病视网膜病变的发病过程中起着至关重要的作用［11-12］。PI3K-Akt信号通路是一条经典的胰岛素代谢通路，同时在炎症反应中也有很大作用［13］。山药还可调节其他多条通路，说明其可通过多靶点，多途径发挥治疗T2DM的作用。

综上所述，本研究通过网络药理学方法对山药治疗T2DM的有效成分、关键靶点、显著信号通路进行研究，发现其主要活性成分一方面可直接调节糖脂代谢，对T2DM起到治疗作用，另一方面还可以调控细胞凋亡、调节炎症反应等，间接发挥治疗作用。本研究为天然药食同源中药产品的开发提供了理论依据。