重铬酸钾染毒对大鼠子一代肺毒性作用

吴倩 刘增泽 刘燕群 林可欣 管庆美 鲁雄兵 张龙 谌宗尧 刘盈辉

江汉大学医学院，湖北 武汉430056

铬在人类生活中广泛存在，分为自然来源和人类活动产生两种，自然来源包括岩石、水、大气及土壤等自然环境中存在的铬，人类工业生产也会产生大量铬［1］。铬大多数以六价及三价形态存在，三价形态铬不具有毒性，六价形态铬具有毒性。皮革和电镀行业的生产过程中会产生大量的六价铬，废水和废渣处理不当可能会导致六价铬渗透入耕地，经过蓄积作用被农作物吸收；此外，废水乱排放可能会导致六价铬污染饮用水，人类食入污染的作物或饮用水会造成六价铬在人体内蓄积，从而损伤机体。研究显示，六价铬可通过接触人体皮肤和呼吸道途径进入人体，造成基因毒性、染色体畸变以及致癌等严重危害，长期从事金属冶炼工作的工人会出现鼻出血、鼻中隔穿孔、呼吸道癌及肺癌等疾病［2-3］。既往研究显示，六价铬可在鼠体内蓄积，并具有毒性作用［4］，且六价铬能对大鼠的胚胎造成损伤，影响仔鼠的生殖与发育［5-6］。本研究探讨不同浓度重铬酸钾对大鼠仔鼠肺脏的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物 SPF级SD大鼠，合格证号：No.110011 1911015206，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。大鼠毛发有光泽，身体状况和食欲良好。将大鼠雌雄分开并置于室内（24±1）℃进行适应性喂养一周，待实验。

1.2 实验仪器与试剂 重铬酸钾（山东西亚化学股份有限公司，纯度99.8%）；JA2003B电子天平（上海越平科学仪器有限公司）；台式离心机（Heal Force，PL-203）；纯水仪（青岛富勒姆科技FBZ2001-UP-P）；微型旋涡混合器（Servicebio，MX-F）；水浴锅（姜堰市天力医疗器械厂有限公司，TL-420D）；全自动研磨仪（武汉康涛科技有限公司）；自动洗板机（Rayto KZ-Ⅱ）；酶标检测仪（BioTeK，Epocchao）；超声细胞粉碎机（宁波新芝生物，JY92-‘’Ⅱn）；生理盐水（0.9%）；ELISA试剂盒（联科生物）。

1.3 溶液配制 将重铬酸钾晶体配制成1/2LD50、1/4LD50、1/8LD50的溶液各500mL，保存于冰箱中（4℃），以供后续实验大鼠灌胃所需。

1.4 实验方法及观察指标

1.4.1 预实验。共分四组，即空白组，低、中、高浓度组，每组2只雌鼠，1只雄鼠。在适应性喂养结束后于上午9点合笼，雌雄比2∶1。第二天上午9点做阴道涂片，检测雌鼠是否成功受孕。以从显微镜下观察到精子为怀孕第一天，次日起开始灌胃。每天根据雌鼠体重取相应量重铬酸钾进行灌胃，正常饲料和水喂养大鼠，直至生出仔鼠后断奶。仔鼠断奶后，对饮食及运动进行观察，取仔鼠肺脏，用滤纸对组织表面进行脱水，电子天平称量组织块，根据预实验结果确定正式试验重铬酸钾浓度。肺组织匀浆操作步骤：①从肺脏组织取下大小为3mg的块状组织。②将组织块置于生理盐水（4℃）中，反复漂洗三次，以去除组织块内的血液，用滤纸拭干组织块表面水分。③组织块称重后将其放入烧杯。④用移液管量取4℃的生理盐水于烧杯内，且生理盐水总体积与肺组织块重量之比为9∶1，使组织块浸泡于生理盐水中。⑤在冰水浴条件下，将浸泡的组织块用眼科剪快速剪碎。⑥剪碎的组织块超声粉碎，制备成10%肺组织匀浆，然后用移液枪移入离心管，以3000r/min，离心10min。⑦移液枪取上清液，用ELISA法测定炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。运用HE染色对仔鼠肺组织进行染色，观察组织形态学变化。

1.4.2 正式试验。根据预实验结果，1/2LD50、1/4LD50、1/8LD50重铬酸钾溶液对肺有一定影响，且老鼠存活率较高，所以正式试验依旧采用此浓度重铬酸钾溶液。根据预实验方法，将雌鼠分四组，空白组，低、中、高浓度染毒组。其中空白组3只雌鼠，低、中、高染毒组各4只雌鼠。将大鼠按照雌雄比2∶1的比率合笼，按照预实验的方法测定雌鼠怀孕日期并记录，于次日开始对大鼠染毒，连续灌胃至仔鼠出生后断奶（21天），各组仔鼠数量（不分雌雄），空白组18只、低浓度组22只、中浓度组14只、高浓度组24只。每组取8只仔鼠断奶后取肺脏，滤纸脱水，称重计算脏器系数。每组取4只仔鼠采用ELISA法检测肺组织匀浆中的TNF-α、IL-6、IL-1β炎症因子含量，对肺组织进行HE染色。

1.5 统计学分析 应用SPSS19.0统计软件进行数据分析，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间两两比较采用LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组肺脏脏器系数比较 各浓度重铬酸钾组大鼠子一代的脏器系数均高于空白组（P＜0.05），且随着重铬酸钾浓度升高，肺脏脏器系数增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组肺脏脏器系数比较（%，±s）

表1 各组肺脏脏器系数比较（%，±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05

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2.2 各组TNF-α、IL-1β、IL-6含量比较 各浓度重铬酸钾组的大鼠子一代的TNF-α、IL-1β、IL-6炎症因子的浓度均高于空白组（P＜0.05），且随着重铬酸钾浓度升高，各炎症因子浓度增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组TNF-α、IL-1β和IL-6含量比较（pg/mL，±s）

表2 各组TNF-α、IL-1β和IL-6含量比较（pg/mL，±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05

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2.3 HE染色 不同浓度重铬酸钾染毒仔鼠与空白组小鼠肺组织HE染色切片对比，随着重铬酸钾浓度上升，肺组织形态学变化越加明显。见图1。

图1 不同浓度HE染色 40×

3 讨论

重铬酸钾中的铬为六价，六价铬具有强氧化性，而六价形态的铬可对大鼠的卵黄囊有损伤，且能够透过大鼠的胎盘屏障［7］，其强氧化性可对亲代大鼠脏器及亲代胚胎发育形成一定损害。母乳喂养子一代也可能是六价铬进入子一代体内方式之一，以上两种方式进入子一代的六价铬可能对子一代的肺脏形成损伤，致使肺脏脏器系数及相关炎症因子发生变化。肺脏的脏器系数增大表示肺脏存在充血、水肿或增生肥大等病理变化［8］。本实验结果显示，不同浓度的重铬酸钾组脏器系数均较空白组升高，说明重铬酸钾可能会导致子一代的肺脏出现上述各种病理变化，且子一代脏器系数随着重铬酸钾的浓度升高而升高，表明重铬酸钾可对子一代肺脏发育形成毒性损害。TNF-α，IL-1β和IL-6均为促炎细胞因子［9-10］，炎症因子浓度升高表明子一代肺脏受损，高、中、低重铬酸钾组与空白组相比肺组织匀浆的炎症因子TNF-α，IL-1β及IL-6的浓度均高于空白组，且随着重铬酸钾浓度的增高，组织匀浆的炎症因子TNF-α，IL-1β及IL-6的浓度也相应增高。说明重铬酸钾可导致仔鼠肺脏发生炎症反应，其炎症程度随着重铬酸钾浓度的增加而增加，但是其损伤机制需要进一步的实验及检测研究证实。仔鼠的肺组织HE染色切片显示，随着重铬酸钾浓度的增高，子一代的肺间质炎性细胞逐渐增生，组织细胞水肿逐渐严重，而间质血管逐渐消失。说明给予亲代大鼠灌胃的重铬酸钾浓度越高，对子一代大鼠肺脏影响越大。

综上所述，重铬酸钾可对子一代大鼠的肺脏造成损伤，且随着重铬酸钾浓度的增加，子一代肺脏损伤越严重。