葡甘聚糖酶制备魔芋葡甘露低聚糖的工艺研究

仝泽方，李利军，卢美欢，马英辉，吴文朋

(陕西省微生物研究所，西安 710043)

魔芋是天南星科魔芋属多年生草本植物，魔芋葡甘聚糖是其主要活性成分[1]。魔芋葡甘聚糖为水溶性膳食纤维，有辅助医疗和保健作用，是一种优良的食品添加剂[2]。然而，由于其分子量大，具有遇水后高膨胀、高黏度的特性，过量摄入将引起抗营养作用，从而使其应用受到限制[3]。葡甘聚糖酶可以将魔芋精粉中的葡甘露聚糖分解为2～10个单糖单位，并以β-1,4或β-1,3糖苷键连接，生成具有直链或支链的魔芋葡甘露低聚糖[4-5]。有研究表明，魔芋葡甘露低聚糖除了具有低热量、稳定和安全无毒等良好的理化性质外[6]，对以双歧杆菌为代表的有益菌群也有明显的促生长作用，不但可以改善肠道内菌群结构，还能够增强机体免疫力。有试验证明，魔芋葡甘露低聚糖还有明显的降脂作用，可以作为高血脂糖尿病的辅助治疗产品[7-8]。同时，葡甘露低聚糖还具有清除自由基，吸附病原菌和抑制肠内氨的形成和吸收等良好的作用[9]。魔芋葡甘露低聚糖因其诸多优良的理化性质分别在食品工业领域、生物医学领域、功能材料领域应用广泛。

尤其是在食品工业中，魔芋葡甘露低聚糖不仅可以用于保健食品和食品添加剂，也可作为原材料制成食品保鲜膜[10-11]。文本主要利用酶法生产葡甘露低聚糖，研究了不同因素对其制备低聚糖工艺的影响，并对其工艺条件进行了优化。

1 材料与方法

1.1 材料

葡甘聚糖酶：自制；魔芋精粉：陕西锦泰魔芋产业发展有限公司；DNS试剂：配制。

1.2 仪器及设备

722型分光光度计 天津市普瑞斯仪器有限公司；PHS-3C精密酸度计 上海大普仪器有限公司；HH-S4电热恒温水浴锅 北京科伟永兴仪器有限公司；电子万用电炉 天津市泰斯特仪器有限公司；JM-B 10002电子天平 余姚市纪铭称重校验设备有限公司。

1.3 葡甘聚糖酶的制备

黑曲霉3758由陕西省微生物研究所菌种资源中心选育和保藏，经过筛选驯化选育出葡甘聚糖酶产量高的黑曲霉菌株。利用麸皮、豆粕、魔芋胶以及少量无机盐组成的固体培养基，接种该黑曲霉菌株在30 ℃发酵72 h，然后经浸泡提取获得葡甘聚糖酶粗酶液，酶活力可达到6000 U/mL。

1.4 试验方法

1.4.1 酶活力测定

以5.0 g/L魔芋胶为底物溶液。加入适量葡甘聚糖酶，在pH 5.5、50 ℃恒温水浴锅中反应15 min；采用DNS法测定酶解液中还原糖的量。在上述条件下，以每1 min酶解底物产生1 μmol还原糖(以甘露糖计)的酶量定义为1个β-甘露聚糖酶活力单位(U)[12]。

1.4.2 葡甘露低聚糖的制备

配制一定量的pH为5.8的醋酸-醋酸钠缓冲液，置于250 mL的锥形瓶中，加入一定量的魔芋粉溶液和葡甘聚糖酶，于恒温摇床中以200 r/min反应一定时间后，测定酶解液中的甘露糖含量。

1.4.3 单因素试验

按照葡甘露低聚糖的制备方法，以还原糖得率为考察指标，依次进行12个魔芋粉浓度5，10，15，20，25，30，40，50，60，70，80，90 g/L；12个酶添加量36.14，50.04，61.16，75.06，86.18，100.08，113.98，125.1，136.22，150.12，161.24，175.14 U/g；9个pH值1，2，3，4，5，6，7，8，9；15个反应温度25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95 ℃；9个反应时间1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00，8.00，10.00，24.00 h的单因素试验。每个水平重复3次，测定结果取平均值。

1.4.4 正交试验

依据单因素试验结果，以还原糖得率为考察目标，选择魔芋粉浓度、酶添加量和反应时间，设计三因素三水平正交试验L9(34)，并重复3次，结果取平均值，最后通过极差分析和单因素试验结果确定葡甘露低聚糖制备的最佳工艺。

2 结果与讨论

2.1 魔芋胶酶解条件单因素试验

2.1.1 酶添加量的影响

在pH为5.8、温度为40 ℃、反应时间为2 h、魔芋胶浓度为10 g/L的条件下探究酶添加量对还原糖转化率的影响，结果见图1。

图1 酶添加量对还原糖得率的影响Fig.1 Effect of enzyme additive amount on the yield of reducing sugar

由图1可知，随着酶添加量的逐渐增多，还原糖转化率也在提升，但当酶的添加量大于150 U/g之后，还原糖转化率趋于平稳，不再有明显的提升。因此，在保证产物中葡甘露低聚糖含量的前提下，要尽量减少葡萄糖和甘露糖等单糖的量，就需控制魔芋胶的酶解程度。

2.1.2 底物魔芋粉浓度的影响

在pH为5.8、温度为40 ℃、反应时间为2 h、酶添加量为61.16 U/g的条件下探究底物浓度对还原糖转化率的影响，结果见图2。

图2 底物浓度对还原糖得率的影响Fig.2 Effect of substrate concentration on the yield of reducing sugar

由图2可知，随着底物浓度的逐渐增加，还原糖转化率逐渐升高，但变化趋势并不显著。可以推测随着魔芋胶浓度的增加，底物粘度增大，可能会影响酶解反应的继续进行。因此选择底物浓度为10～30 g/L。

2.1.3 酶解pH的影响

在温度为40 ℃、反应时间为2 h、酶添加量为61.16 U/g、底物浓度为10 g/L的条件下探究酶解pH对还原糖转化率的影响，结果见图3。

图3 pH对还原糖得率的影响Fig.3 Effect of pH value on the yield of reducing sugar

由图3可知，当pH值小于4时，随着pH值的增大，还原糖转化率逐步提升，在pH为4时最大。但是当pH在4～9区间时，还原糖转化率一直是下降的趋势。这是由于葡甘聚糖酶的最适pH可能为4左右，pH大于4时减弱了葡甘聚糖酶的活性，导致酶解反应速度减慢，还原糖转化率的降低。

2.1.4 酶解温度的影响

在pH为5.8、反应时间为2 h、底物浓度为10 g/L，酶添加量为61.16 U/g的条件下探究酶解温度对还原糖转化率的影响，结果见图4。

图4 温度对还原糖得率的影响Fig.4 Effect of temperature on the yield of reducing sugar

由图4可知，在25～75 ℃之间，随着温度的升高，还原糖转化率整体呈现上升趋势，并在75 ℃时达到最高。而当温度一旦高于75 ℃时，还原糖转化率呈下降趋势。这可能是由于温度过高破坏了酶的蛋白质结构，导致了部分变性，故而影响了酶与底物的反应，导致还原糖转化率降低。

2.1.5 酶解时间的影响

在pH为5.8、温度为40 ℃、底物浓度为10 g/L、酶添加量为61.16 U/g的条件下探究酶解时间对还原糖转化率的影响，结果见图5。

由图5可知，在1～4 h内，还原糖转化率随着反应时间的延长而逐渐增加；在4～10 h内，还原糖转化率的变化并不明显，趋于平稳；在10 h之后，还原糖转化率又呈下降趋势。因此，对于酶解反应存在着最佳反应时间，反应时间一旦过长，有可能造成低聚糖进一步水解为单糖，导致还原糖转化率降低。

图5 时间对还原糖得率的影响Fig.5 Effect of time on the yield of reducing sugar

2.2 魔芋胶酶解条件正交试验

选择酶添加量、魔芋胶浓度、酶解时间3个因素，利用正交试验表L9(34)进行三因素三水平正交试验，见表1。

表1 正交试验结果与分析Table 1 Orthogonal experiment results and analysis

由表1可知,极差RA>RB>RC，因此影响因素底物浓度>酶添加量>酶解时间。最佳条件为A1B3C2，即酶解最佳条件为：酶添加量80 U/g，底物浓度10 g/L，酶解时间4 h。而之后所做的酶解最佳条件的验证试验也证明了这一点，在上述条件下，还原糖转化率为93.21%。

2.3 讨论

通过单因素试验发现酶添加量、底物浓度、pH值、反应时间和温度对还原糖转化率的影响并不只是线性关系。在此基础上进行的正交试验表明其中影响程度最大的是底物浓度，影响最小的是反应时间，并且进一步筛选出酶解最佳条件：pH 5.8，反应温度75 ℃，底物浓度10 g/L，酶添加量80 U/g，反应时间4 h。经过酶解最佳条件的验证试验，还原糖转化率可达93.21%。

有文献表明，酸解法和超声波法分解魔芋葡甘聚糖时所用物质酸度过高，造成的环境污染严重，且产物分子量不易控制，相较于酶解法效果不佳[13]。按照上述酶解法来分解魔芋葡甘聚糖是目前实验室获取魔芋葡甘低聚糖的主要方法，李剑芳等利用黑曲霉菌株LW-1所产酸性β-甘露聚糖酶制备魔芋葡甘露低聚糖，该酶制备葡甘露低聚糖的工艺条件为：魔芋胶浓度150 g/L，加酶量50 U/g，50 ℃水解6 h，在上述条件下，酶解产物主要是2～10个单糖单位的葡甘露低聚糖。许牡丹等利用黑曲霉β-甘露聚糖酶探究了制备葡甘露低聚糖的最佳工艺条件，魔芋粉浓度2.0%，加酶量108 U/g，反应温度65 ℃，pH 4.2，反应时间4.0 h，葡甘露低聚糖产率可达32.3%，并且本试验方法中还原糖得率也能达到93.21%，相对于其他工艺有明显优势。但对于工业生产来说，固定化酶能显著缩短水解时间，降低生产成本，并能实现连续化生产[14]，所以固定化酶解工艺还需进一步研究。

近年来，针对魔芋葡甘露低聚糖的研究已逐渐增多，并且其理化特性也在诸多领域应用广泛，尤其是在食品工业方面。魔芋葡甘露低聚糖的增稠性能使其常用于肉制品和淀粉制品中提升产品的感官和质地，而合理利用魔芋葡甘露低聚糖的流变性能可以提升产品的质地和口感，并且其良好的成膜性可用于果蔬涂膜保鲜方面和生物医药领域。但魔芋葡甘露低聚糖在食品、饮料、营养补充剂，生物医学和功能材料方面还需要进一步的深入研究，并且也具有广阔的应用前景。