分散液液微萃取/气相色谱-串联质谱技术联用快速测定酱油中糠醛类物质

周斌，杨坤

(1.杭州市食品药品检验研究院，杭州 310022；2.黔东南州食品药品检验检测中心，贵州 凯里 556012)

糠醛类物质包括糠醛、5-甲基糠醛和5-羟甲基糠醛，是一组重要的呋喃结构化合物[1]，广泛存在于各种食品中，例如面包、酒类、果酱、醋和酱油等[2-6]。糠醛类物质来源于食品加工中与糖相关的反应，如美拉德反应、酸性水解或焦糖化反应等[7-8]。含糖食物在热处理或长期储存过程中，糠醛和5-羟甲基糠醛含量显著增加，导致食物的颜色、质地和风味发生变化[9]。因此，糠醛类物质被认为是多种食物新鲜度和质量的重要指标[10]。5-羟甲基糠醛还是一种能与人体蛋白结合产生的毒素，会刺激眼结膜，损害内脏[11-12]。目前我国食品安全国家标准 GB 2760-2014《食品添加剂使用标准》中，糠醛、5-甲基糠醛允许作为食品香料使用。目前国内外测定糠醛类物质的方法主要有数字图像比色法[13]、示差分光光度法[14]、固相微萃取气相色谱法[15]、顶空固相微萃取气相色谱-质谱法[16-18]、高效液相色谱法[19-21]和同位素稀释液相色谱-质谱法[22]。

分散液液微萃取技术是通过形成稳定的萃取剂/分散剂/样品溶液乳浊液体系，使待测物在样品溶液及萃取剂之间快速达到分配平衡而完成萃取。因其方法简单易行、环境污染少、成本低、灵敏度高等优点，已应用于环境分析、食品中有害物质的分析[23]。本文将分散液液微萃取技术和气相色谱-串联质谱法结合测定酱油中糠醛类物质含量，对样品的前处理方法及GC-MS/MS分析条件进行优化，通过对酱油中糠醛类物质进行分析，验证了该方法的有效性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

标准品：糠醛、5-甲基糠醛和5-羟甲基糠醛(百灵威科技有限公司，纯度≥98%)；氯苯、三氯甲烷、四氯乙烯、乙腈、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷(色谱纯，美国 Thermo Fisher Scientific公司)；实验用水为蒸馏水。

1.2 仪器与设备

CP450-300MS GC-MS/MS 美国Bruker公司；高速离心机 上海Heal Force公司；Milli-Q 装置 美国Millipore公司；ME802型电子天平 上海梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

1.3.1.1 标准储备液

将糠醛、5-甲基糠醛、5-羟甲基糠醛用乙酸乙酯配制成质量浓度为2000 mg/L的标准储备液，于4 ℃冰箱中保存。

1.3.1.2 标准工作液

吸取合适的储备液，用三氯甲烷逐级稀释成0.002，0.01，0.05，0.2，0.5，1，5，10 mg/L的标准工作液。以质量浓度(X)为横坐标，离子峰面积(Y)为纵坐标，用外标法绘制标准工作曲线。

1.3.2 样品前处理

称取2 g试样(精确至0.01 g)于20 mL刻度离心管中，加入10.0 mL乙腈，涡旋10 min。准确吸取1 mL乙腈提取溶液作为分散剂，于15 mL尖底塑料离心管中，加入5 mL水，涡旋混合后迅速加入100 μL三氯甲烷，涡旋3 min，6000 r/min离心5 min。用微量注射器抽取离心管底部的三氯甲烷，进行GC-MS/MS分析。

1.3.3 气相色谱-串联质谱方法

色谱柱：VF-WAXms(30 m×0.32 mm×1.0 μm)弹性石英毛细管柱；进样口温度230 ℃；柱升温程序：初温50 ℃保持0.5 min，以25 ℃/min的速率升温至230 ℃保持6.5 min，共15 min；载气：高纯氦气(99.999%)；柱流量1.0 mL/min；恒定流量模式；进样量：1.0 μL。电子轰击源(EI)；离子源温度230 ℃；传输线温度250 ℃；腔体温度40 ℃；溶剂延时4.5 min；分段扫描；碰撞气：氩气，压力为0.2 Pa(1.5 m Torr)。

3种物质的母离子、子离子和多反应监测(MRM)参数见表1。

表1 3种物质的定性及定量选择离子和MRM参数Table 1 The qualitative and quantitative selection of ion and MRM parameters of the three furfurals

1.3.4 正交实验

影响分散液液微萃取的因素有萃取剂体积、分散剂体积、水的体积、萃取时间等。本实验通过对以上4个因素进行正交实验，测定5-甲基糠醛的回收率的影响，确定最优萃取条件。影响萃取效率的各因素水平见表2。

表2 萃取实验各因素水平Table 2 The factors and levels of three furfurals＇ extraction test

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

3种糠醛类化合物均属于极性化合物，应采用极性低流失VF-WAXms色谱柱进行测定。分别进3种物质标准溶液，通过全扫描(Scan)模式，确定化合物的结构信息、保留时间。选择峰强度最高的离子作为母离子，做进一步子离子扫描，分别选择较高响应和干扰少的子离子作为定量和定性离子，对各子离子碰撞能量进行优化；3种糠醛类化合物的混合标准溶液总离子图(TIC)见图1，3种化合物峰形良好，响应较高，无杂质干扰。

图1 3种糠醛类物质标准品总离子流图Fig.1 Total ion current chromatogram of standard samples of three furfurals

2.2 提取溶剂的优化

使用不同溶剂对3种糠醛类化合物的提取效率差别比较大。糠醛类物质属于极性物质，根据“相似相溶”原理，极性溶剂的提取效率较高。

由图2可知，乙腈作为提取溶剂时，糠醛和5-甲基糠醛的回收率均大于85%，5-羟甲基糠醛的回收率为88.4%，明显高于乙酸乙酯68.8%，二氯甲烷的66.7%和丙酮的66.2%。此外，乙腈作为提取溶剂时，不易提取油脂类物质，可以减少杂质干扰，故本次实验采用乙腈作为提取溶剂。

图2 使用不同提取溶剂时3种糠醛化合物的回收率Fig.2 The recovery rates of three furfurals under different extraction solvents

2.3 萃取溶剂的优化

萃取剂需满足以下要求：萃取剂与水较小溶解能力，密度必须大于水以便萃取溶剂沉淀至底部；对目标化合物的溶解性好；能满足后续色谱分析。常用的萃取剂有二氯甲烷、氯苯、三氯甲烷、四氯乙烯等。

图3 萃取剂种类对回收率的影响 Fig.3 The effect of different types of extraction solvents on the recovery rates

由图3可知，由于二氯甲烷易挥发，萃取液体积变化大，实验结果的重现性较差；三氯甲烷的萃取回收率(88.8%～97.8%)比氯苯(84.6%～93.1%)和四氯乙烯(77.9%～92.1%)要好，四氯化碳在水中的溶解度较小，可以减少萃取剂损失，故选择三氯甲烷为待测物的萃取溶剂。

2.4 萃取剂、分散剂、水的体积及萃取时间的选择

以三氯甲烷为萃取剂，乙腈提取液为分散剂，通过正交实验进行DLLME测定，以5-甲基糠醛含量计算回收率。

图4 萃取剂、分散剂、水的体积及萃取时间对回收率的影响Fig.4 The effects of extractant volume,dispersant volume,water volume,extraction time on the recovery rates

由图4中a可知，萃取剂三氯甲烷的体积大于100 μL时，回收率变化不大，因此选择萃取剂的体积为100 μL。

由图4中b可知，分散剂的体积为1.0 mL时萃取效率最高。原因可能是随着分散剂体积增加，待测物在水中的分散程度增大，溶解度增加，使得萃取效率随之降低。

由图4中c可知，随着水的体积的增加，5-甲基糠醛的回收率不断上升；当水的用量大于5 mL时，萃取效率随之下降。原因可能是水的用量过大时，较多萃取剂溶解在水中造成损失，导致萃取效率降低。因此，实验选择水的用量为5 mL。

由图4中d可知，时间为1 min以后快速达到萃取平衡，最佳萃取时间为1 min。

2.5 标准曲线、线性范围及检出限

在经过优化的样品前处理和GC-MS/MS分析条件下，3种糠醛的检出限、定量限、线性回归方程、相关系数、线性范围结果见表3。3种糠醛在0.002～10 mg/L范围内呈良好的线性关系，相关系数R>0.999，检出限LOD以定量离子3倍信噪比(S/N=3)计，定量限LOQ以S/N=10计，可满足实际样品的测定。

表3 3种糠醛物质的检出限、定量限、线性方程、相关系数及线性范围Table 3 The LODs,LOQs,regression equations,correlation coefficients and linear ranges of three furfurals

2.6 方法的添加回收率、精密度

取不含本底的酱油样品5份，每份2.00 g，分别添加0.1，0.5，10.0 mg/kg 3个水平质量浓度的3种糠醛化合物的标准储备液。按1.3.2的方法测定回收率，每个水平测定5次，结果见表4。

表4 3种糠醛类物质的添加回收率和精密度(n=5)Table 4 The recovery rates and precision of three furfurals (n=5)

结果显示：在0.1，0.5，10.0 mg/kg 3个添加水平下，平均回收率为87.6%～100.2%，相对标准偏差(RSD)为2.1%～8.3%，满足定量分析的要求。

2.7 实际样品的测定

使用本方法对不同品种酱油中的糠醛、5-甲基糠醛、5-羟甲基糠醛进行实际检测。检验结果显示：糠醛含量在0～1.1 mg/kg，5-羟甲基糠醛含量在0～7.8 mg/kg左右。这可能与食品加工过程中蛋白质与糖类发生美拉德反应产生糠醛物质有关；也与酱油的酿造发酵工艺产生糠醛类风味物质有关。

3 结论

本文将分散液液微萃取技术与气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)相结合应用于酱油中3种糠醛类物质的检测，选择性好，灵敏度高，操作简单，没有繁琐的净化和提取过程。目前常用的糠醛类物质含量的检测方法主要有紫外分光光度法和高效液相色谱法，无法检测到糠醛类化合物含量较低的食品。本方法的检出限可达0.01 mg/kg，有更高的灵敏度，可以为酱油的加工工艺提供理论基础，同时为研究监测酱油中美拉德反应产生的有毒有害物质含量提供了新的思路。