食醋酿造用玉米化学成分变化对玉米赤霉烯酮提取的影响

高建伟，张浩楠,于丽萍,金吉东,贾文影,张舵

(1.齐齐哈尔大学 食品与生物工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006;2.科菲特饲料(齐齐哈尔)有限公司，黑龙江 齐齐哈尔 161200)

玉米发酵食醋是以玉米为主要原料，采用发酵和酶法相结合的技术制备而成[1]。原料发酵后，既可提高营养价值，又可合成氨基酸、维生素等，显著提高利用率[2-4]。玉米醋不但具有维生素、氨基酸等功能成分，而且具有抗衰老、抗心脑血管疾病、增强机体免疫力等作用[5]。玉米富含的碳水化合物、蛋白质等物质，为微生物的生长繁殖提供了天然培养基，微生物的代谢加速易导致玉米品质发生变化，产生霉菌。玉米霉变不仅降低营养和商品价值，还会对其食用性和安全性造成影响。

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)最初发现于玉米赤霉病，世界范围内谷物和饲料均易污染。ZEN由Stob等[6]从禾谷镰刀菌污染玉米中首次分离。全球有19个国家制定了食品中ZEN的限量标准，欧盟规定食品中ZEN残留限量标准为200 μg/kg，我国规定玉米、小麦及制品中ZEN的含量不得超过60 μg/kg[7]。ZEN体外检测方法主要有三类[8]，即化学检测法、免疫学检测法[9]和时间分辨荧光技术检测法。

近年来对ZEN等食品有害物检测体系的研究领域非常活跃，包括超高效液相色谱[10]、快速免疫分析方法、高通量检测技术、生物传感器在线检测技术等[11]。ELISA法具有快速、高通量等特点，适用于食品中ZEN的检测，但是ELISA方法在样品定量分析时常发生测定值偏差的现象，涉及原因众多，样品前处理就是原因之一。虽然可采用超声波、超临界等方案辅助提取,但有悖于ELISA快速简便的初衷，因此，在确保ELISA方法简便、快速的基础上如何改善样品前处理的影响，提高ELISA检测的稳定性备受学者关注。

本研究在样品前处理阶段选取ZEN为实验对象，以ELISA方法测定ZEN提取率为指标，用UPLC-MS方法进行验证，分析玉米样品中化学成分的变化对ELISA检测结果的影响，发现影响提取效果的部分因子，进而可以为现代快速检测体系中简便高效的提取方法研究提供一些研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米样品：采自齐齐哈尔市梅里斯区雅尔塞镇东风村；ZEN、TMB：购自美国Sigma公司；甲醇、碳酸氢钠等：购自天津市广成化学试剂有限公司；HRP-羊抗小鼠IgG：购自碧云天生物公司；ZEN单克隆抗体：本实验室制备。

1.2 仪器与设备

Victor酶标仪 美国通用电器公司；马弗炉 苏州华隆工贸有限公司；脂肪测定仪 意大利VELP公司；TGL-16M台式高速冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；超高效液相色谱/四极杆-轨道阱质谱联用仪 赛默飞世尔科技公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米样品前处理

根据甄玉萍等[12]的实验采用高速万能粉碎机粉碎玉米，粉碎时间为180 s时，70%的甲醇水溶液提取，将处理后的玉米置于以下3种环境下保存：

通风干燥：用四分法取一定量的粉碎玉米样品，装在干净塑料袋中敞口置于实验室，温度约为15～25 ℃，保持良好通风。

低温密封：用四分法取一定量的粉碎玉米样品，装在干净塑封袋中，置于4 ℃冰箱中保存。

高温高湿：用四分法取一定量的粉碎玉米样品，用干净的器皿盛装，置于30 ℃恒温箱中，并用饱和食盐水控制湿度在75%左右。

在储藏10，20，30，60，90 d用四分法取样测定。

1.3.2 间接竞争ELISA

1.3.2.1 样品前处理

准确称取一定量样品加入100 ppb ZEN标准品充分混匀，烘干后样品置于15 mL离心管中，加入2 mL 70%甲醇水溶液进行提取；涡旋混匀5 min，4000 r/min离心5 min；取上清液400 μL，加入600 μL稀释液；涡旋混匀做待测样品。

1.3.2.2 实验方法

根据本实验室建立的间接竞争ELISA优化检测条件操作[13]。

1.3.3 UPLC-MS检测方法

1.3.3.1 样品前处理

准确称取5 g粉碎样品于50 mL离心管中加入20 mL 70%甲醇水溶液；用涡旋混合器混匀5 min，摇床振荡30 min，室温下4000 r/min离心10 min；取0.5 mL上清液于15 mL离心管中，加入9.5 mL PBS稀释液；过0.22 μm滤膜，做待测样品。

1.3.3.2 实验方法

超高效液相色谱/四极杆-轨道阱质谱联用仪的色谱条件见表1，质谱条件见表2。根据仪器操作要求加样，以ZEN标准品浓度为横坐标，ZEN出峰时间处的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

表1 色谱条件Table 1 The chromatographic conditions

续 表

表2 质谱条件Table 2 The mass spectrometry conditions

1.3.4 水分含量变化对ZEN回收提取的影响

参照GB 5009.3-2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》中直接干燥法测定水分含量[14]。

1.3.5 粗脂肪含量变化对ZEN回收提取的影响

参照GB 5009.6-2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》中索氏抽提法测定脂肪含量[15]。

1.3.6 粗蛋白含量变化对ZEN回收提取的影响

参照GB 5009.5-2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》中凯氏定氮法测定蛋白质中的总氧含量[16]。

1.3.7 灰分含量变化对ZEN回收提取的影响

参照GB 5009.4-2016《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》[17]。

1.3.8 ZEN的回收提取实验

分别称取上述1.3.4～1.3.7中的粉碎玉米样品，添加100 ppb ZEN标准品，充分均匀，烘干后分别采用间接竞争ELISA法及UPLC-MS法联合检测，计算ZEN添加回收率。

1.4 统计学分析

使用SPSS 19.0 统计软件对实验数据进行分析处理，进行单因素方差分析，定义P<0.05为差异显著，有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

2.1.1 间接竞争ELISA法标准曲线

分别以浓度为0，0.2，0.6，1.8，5.4，16.2 μg/kg的ZEN标准品为横坐标，以OD值为纵坐标，用Origin 软件选择四参数Logistic绘制标准曲线，得到标准曲线方程：y=2.7599/[1+(x/0.6616)0.7332]+0.0761，R2=0.9969，标准曲线见图1。

图1 间接竞争ELISA法ZEN标准曲线Fig.1 ZEN standard curve of indirect competitive ELISA method

2.1.2 UPLC-MS法标准曲线

分别以浓度为0，0.6，5.4，38，122 μg/kg的ZEN标准品为横坐标，以9.8 min处出现的峰面积为纵坐标，用Excel绘制标准曲线，得到标准曲线方程：y=144315x+316785，R2=0.9989，UPLC-MS标准曲线见图2。

图2 UPLC-MS法ZEN标准曲线Fig.2 ZEN standard curve of UPLC-MS method

2.2 UPLC-MS法测定玉米样品中ZEN含量色谱图

用UPLC-MS法测得的玉米样品中ZEN含量的色谱图见图3，9.8 min处为ZEN的出峰时间。

图3 UPLC-MS法测玉米样品中ZEN含量色谱图Fig.3 Chromatogram of ZEN content in corn samples measured by UPLC-MS

2.3 水分含量变化

图4 不同储藏温度下玉米样品中水分含量随储存时间的变化Fig.4 The changes of moisture content in corn samples with storage time at different storage temperatures

由图4可知，在90 d的储藏期内，同一初始水分的样品，30 ℃/饱和盐溶液条件下玉米水分在22.12%～24.57%之间波动，整体处于平稳趋势；4 ℃下的玉米水分整体呈下降趋势，下降趋势平缓；常温下的玉米水分含量由24.57%下降到5.64%，下降趋势显著。3种环境下样品水分含量不同，可能是由于储存条件为30 ℃、75%饱和食盐水条件下，提供了密闭空间的相对湿度，使得水分含量基本处于平稳趋势；4 ℃低温冷藏下，水分略有下降，两种情况下含水量的变化可能是样品在储藏期间环境与微生物的生长繁殖活动有关[18]。

常温条件下随着时间延长，玉米样品的水分含量显著下降，样品敞口放置于空气流通环境中，相对湿度较低，容器中储存的玉米样品上层暴露于空气中，有利于水分的蒸发。因此，比较3种环境条件下水分含量下降趋势为：常温>4 ℃>30 ℃/饱和盐溶液环境。

2.4 粗脂肪含量变化

图5 不同储藏温度下玉米样品中粗脂肪含量随储存时间的变化Fig.5 The changes of crude fat content in corn samples with storage time at different storage temperatures

由图5可知，随着储存时间的延长，在常温下玉米样品粗脂肪含量降低量微小，在5.89%～6.24%之间波动；4 ℃的玉米样品粗脂肪从6.24%下降到2.75%，30 ℃的样品粗脂肪含量从6.24%下降到1.02%，30 d下降速度加快且整体下降趋势更显著。可能与玉米样品在储存过程中水分含量引起的霉菌生长有关。胡元森等[19]认为玉米高水分促进玉米中微生物活性急剧增加，微生物代谢活动旺盛，玉米在储存中霉菌生长和繁殖过程会消耗部分脂肪，脂肪会被分解成游离的高级脂肪酸和甘油物质等，导致粗脂肪含量呈降低趋势，且水分含量越高、粗脂肪降低趋势越显著。

2.5 粗蛋白含量变化

图6 不同储藏温度下玉米样品中粗蛋白含量随储存时间的变化Fig.6 The changes of crude protein content in corn samples with storage time at different storage temperatures

由图6可知，在90 d的储藏期内，3种条件下玉米样品粗蛋白含量均无大幅度增减变化，在4 ℃和30 ℃/饱和盐溶液环境下在20 d逐渐出现上升趋势，30 d后呈平稳趋势。粗蛋白含量升高可能与霉菌滋生有关，储藏过程中，霉菌生成的物质一部分转化为非蛋白氮，粗蛋白含量测定是以总氮乘以相应的蛋白质系数得到，非蛋白氮的增加可能会造成粗蛋白增加的假象[20]。殷晶晶等[21]提到在储藏期间玉米中粗蛋白总量基本保持不变，而蛋白质各组分会伴随储藏时间、温湿度发生上升或下降趋势。

2.6 灰分含量变化

图7 不同储藏温度下玉米样品中灰分含量随储存时间的变化Fig.7 The changes of ash content in core samples with storage time at different storage temperatures

由图7可知，在不同环境条件下，随着储存时间的增加，灰分含量并没有明显波动趋势，在1.1%～1.3%之间呈稳定趋势。

2.7 ZEN添加回收率的分析

表3 ELISA回收率及UPLC-MS回收率Table 3 The recovery rates of ELISA and UPLC-MS

续 表

由表3可知，90 d储存期内，常温条件下玉米样品添加回收率在91.8%～94.7%之间，这种趋势是由于水分含量大幅度下降，在玉米储存过程中未引起霉变产生。30 ℃/饱和盐溶液与4 ℃添加回收率变化趋势大体一致，30 ℃下添加回收率整体高于4 ℃，在30～60 d储存期间添加回收率持续升高，分别达到121.4%、112.4%。这可能是因为水分含量较高，玉米样品在储藏期内发生霉变，霉菌的生长繁殖消耗粗脂肪，镰刀菌属等产生ZEN，因此添加回收率会因霉变的产生、粗脂肪含量的减少呈现上升趋势。而在60 d后，毒素积累到一定量，由于引起霉变的不同霉菌数量和种类之间的拮抗作用，在后期储存中，产生玉米赤霉烯酮的镰刀菌属等会逐渐减少，青霉属、曲霉属成为主要霉变的菌属，因此ZEN的添加回收率又呈下降趋势。而在90 d中灰分含量没有因环境、储存时间产生波动，无法将灰分和ZEN提取间产生相关联系。丁斌鹰[22]在豆粕发霉过程中发现粗蛋白的含量变化没有受到霉菌生长及环境温度因素的影响。齐德生等[23]研究玉米的品质变化时也得出此结论。因此，我们推断粗蛋白与ZEN的添加回收率无相关性。

3 讨论与结论

在90 d的储存期内，水分含量在常温、4 ℃冷藏条件下呈不同程度的下降趋势。30 ℃/75%饱和食盐水条件下水分含量变化幅度较小；高水分含量的玉米样品随储存期的延长均发生不同程度霉变，消耗粗脂肪，生成游离的脂肪酸和甘油，玉米赤霉烯酮会随着霉变的发生产生一定量的积累，储存30 d后添加回收率增幅显著增高；粗蛋白和灰分含量在不同储存条件下无明显变化。综上所述，玉米样品在不同储存条件下，随着储存时间的延长水分含量、粗脂肪含量与ZEN的添加回收率均具有一定的相关性，影响程度为水分>粗脂肪。粗蛋白、灰分与ZEN的添加回收率无明显相关性。本次实验确定了食醋酿造用玉米化学成分改变对ZEN添加回收率的影响因子，为ZEN的提取提供了化学因素影响的数据参考，为现代快速检测体系中简便高效的提取方法研究提供了基础，同时也为玉米食醋生产的各个环节提供了真菌毒素监测方法。