新型补骨脂素PAP-1对大鼠动脉粥样硬化的影响及心脏保护作用

缪玉影，戴雨晨，桑明，沈月红，沈旭，曹鹏，周谦

(1.南京中医药大学医学院·整合医学学院，江苏 南京 210023；2.江苏省中医药研究院细胞与分子生物学实验室，江苏 南京 210028；3.南京中医药大学第三临床医学院，江苏 南京 210028；4.南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023；5.南京中医药大学附属中西医结合医院，江苏 南京 210028)

动脉粥样硬化(AS)是一种以顽固性脂质代谢紊乱和炎症为特征的疾病，主要表现为动脉管腔内形成脂质沉积和脂质斑块，血管管腔变狭窄，内膜增厚，甚至形成血栓直至完全堵塞管腔[1]。在AS早期，其标志性病理特征是血管内皮下大量巨噬细胞内脂质蓄积以及泡沫细胞形成，泡沫细胞最终坏死崩解释放出细胞内的胆固醇，构成AS斑块的最主要成分[2]。研究表明，AS与70%的急性心血管事件关系密切，会导致心脏肥大性重构[3]、纤维化[4]和心功能障碍[5]等。目前，他汀类药物是临床防治AS的一线用药，具有确切的降脂、抗炎及稳定斑块的作用[6]。然而，研究结果显示他汀类药物起效时间较长，且存在肝肾损伤和横纹肌溶解等不良反应，临床应用受到一定限制[7]。因此，寻找新的AS治疗药物具有重要意义。

5-甲氧基补骨脂素(5-MOP)又名佛手柑内酯(化学结构式见图1)，是从芸香科植物Rutagraveolens中提取的一种对钾通道Kv1.3具有抑制作用的天然单体[8]，具有抗炎、降脂等药理学活性，临床用于辅助治疗动脉粥样硬化性心脏病，缓解冠心病血管狭窄痉挛症状等[9]。然而，5-MOP具有强光敏感性，使用时常伴有皮肤灼痛、瘙痒，所引起的黑斑可在皮肤上持续数年，甚至产生致癌风险[10-12]。

最近，研究者们提取合成了5-(4-苯氧基丁氧基)补骨脂素(PAP-1)[8](化学结构式见图1)。相较于5-MOP，PAP-1对Kv1.3的阻滞活性提高了1 000倍，且消除了因长波段紫外线照射所致热螺旋-螺旋转变温度增加产生的光敏感毒性[8,13]。同时，PAP-1对P450依赖的CYP2A6或CYP3A4酶的抑制作用降低，因此可以避免体内因药物相互作用产生的不良反应[13]。不仅如此，Wulff团队先后实验证明了PAP-1体内外使用的安全性[14-16]。药理学研究表明，PAP-1具有抗炎活性，可以降低哮喘小鼠气道炎症反应[17]，减轻葡聚糖硫酸钠盐(DSS)诱导的小鼠急性结肠炎严重程度[18]等。Wu等首次报道PAP-1具有减轻AS大鼠不稳定动脉斑块形成的作用，却发现口服PAP-1并不能降低AS大鼠的血脂[19]。鉴于大鼠口服PAP-1的生物利用度较低(10%～20%)[14]，本研究拟通过腹腔注射探讨PAP-1对AS大鼠及心脏损伤的保护作用和可能的机制，为PAP-1治疗AS提供参考依据。

图1 5-MOP和PAP-1的化学结构式

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物与主要试剂 PAP-1购于MCE公司(批号：HY-10015，纯度≥99.69%)；阿托伐他汀(AV)购于MCE公司(批号：HY-B0589，纯度≥99.05%)；玉米油购于SIGMA公司(批号：8001-30-7)；MSR1、ABCA1、GAPDH抗体购于ABclonal公司(批号：A14187，A7228，A19056)；CHO检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所(批号：A111-1-1)；IL-1β，IL-6，TNF-α ELISA试剂盒购于联科公司(批号：70-EK301B，70-EK306，70-EK382)。

1.1.2 主要仪器 Multiskan全波长酶标仪(美国Thermo Scientific公司);CKX41倒置显微镜(日本Olympus公司)；Vevo 3100高分辨动物超声影像系统(加拿大VisualSonics公司)；Axio observer Al倒置荧光显微镜(德国Carl Zeiss公司)。

1.1.3 实验动物 雄性SD大鼠(450±5)g，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK(沪)2013-0016。实验动物饲养于江苏省中医药研究院实验动物中心，饲养温度23～25 ℃，湿度40%～70%。实验过程符合《江苏省实验动物管理条例》等实验动物伦理道德的相关规定，动物实验伦理审查表号：AEWC-20200518-106。

1.2 实验方法

1.2.1 模型建立 20只大鼠在适应性喂养1周后，随机分为对照组(4只)和造模组(16只)。期间对照组大鼠喂养普通饲料，造模组大鼠使用球囊受损结合高脂饲料喂养方法建立AS大鼠模型。球囊损伤术：大鼠麻醉后，仰卧固定，颈部备皮，行颈部正中切口，分离左侧颈总动脉，动脉夹夹闭近心端。在左侧颈总动脉下穿4号丝线，结扎远心端。在靠近血管远端结扎处剪一V形开口，向颈外动脉小心插入球囊导管，顺着血管向下，将导管经过颈总动脉到达主动脉，调节压力泵以608～811 kPa扩张球囊，解开丝线，恢复血流供应，来回缓慢抽动球囊3次，撤出球囊，在靠近颈总动脉分叉处结扎颈外动脉近心端，撤去颈总动脉处丝线和主动脉夹，缝合伤口[20]。术后3 d预防性皮下注射青霉素20万单位，每日1次。

1.2.2 分组和给药 16只造模大鼠，因手术死亡4只，将剩余12只造模大鼠随机分为模型组、PAP-1组和AV组，每组4只。AS是一种弹性动脉壁的慢性炎症疾病，发生过程涉及先天和获得性免疫反应[21]。参考PAP-1腹腔给药的生物利用度[13]和治疗自身免疫性疾病模型大鼠的推荐剂量[22]，PAP-1组大鼠腹腔注射3 mg/(kg·d)的PAP-1(溶于1%DMSO+99%玉米油),AV组大鼠灌胃给予10 mg/(kg·d)的AV(溶于玉米油)[23-24]。模型组和对照组大鼠使用相同体积玉米油灌胃或腹腔注射。各组每日给药1次，连续12周，期间对照组大鼠喂养普通饲料，其余组大鼠喂养高脂饲料。

1.2.3 超声心动图 末次给药后24 h，鼻面罩吸入氧气和异氟烷混合气体使大鼠处于轻度镇静状态，使用Vevo 3100高分辨动物超声影像系统对大鼠进行超声心动图检查。测量左室收缩末期前壁厚度(LVAWs)，左室舒张末期前壁厚度(LVAWd)，左室收缩末期后壁厚度(LVPWs)，左室舒张末期后壁厚度(LVPWd)。根据左室舒张末期容积(VLVd)和左室收缩末期容积(VLVs)计算左室射血分数(EF)，EF=(VLVd-VLVs)/VLVd×100%。

1.2.4 血清血脂和炎症因子检测 各组大鼠腹腔注射10%的水合氯醛(每100 g大鼠体质量给予0.3 mL)麻醉，眼眶静脉取血，分离血清，-80 ℃冰箱保存。采用COD-PAP酶法测定CHO，ELISA法检测TNF-α、IL-6和IL-1β。

1.2.5 组织学分析 颈椎脱臼法处死实验大鼠，分离剪取球囊受损处颈动脉和心脏左室部位，用4%多聚甲醛固定，常规HE染色观察颈主动脉组织形态变化；Masson三色染色和免疫组织化学法检测心脏中Ⅰ型胶原纤维(Col Ⅰ)和Ⅲ型胶原纤维(Col Ⅲ)，炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表达；Image J软件分析测定图像阳性颗粒平均光密度值和心肌细胞面积大小；WGA荧光染色镜检拍照。

1.2.6 Western blot 取各组大鼠球囊受损处颈主动脉组织进行总蛋白提取，采用BCA定量法将蛋白调整到统一浓度。加入上样缓冲液煮样8 min之后进行电泳。用5%脱脂牛奶室温封闭1 h，4 ℃冰箱过夜孵育一抗，后用TBST清洗3遍，室温孵育二抗1 h，TBST清洗3遍。每组实验重复3次。化学发光成像系统曝光，Image J软件分析条带强度。

2 结果

2.1 PAP-1对AS大鼠颈主动脉病理形态的影响

HE染色显示，对照组颈主动脉组织管腔结构完整，血管内膜光滑，无明显增生，平滑肌细胞排列整齐，结构完整，无钙化和泡沫细胞生成；模型组颈主动脉平滑肌细胞增生，内膜增厚，颈主动脉管壁增厚明显；与模型组相比，阳性药AV组与PAP-1组大鼠颈主动脉外观正常，管壁厚度变薄，见图2。

对照组 模型组 PAP-1组 AV组图2 PAP-1对AS大鼠颈主动脉病理形态的影响

2.2 PAP-1对AS大鼠颈主动脉血清CHO含量影响

与对照组相比，模型组大鼠血清CHO含量显著升高(P<0.01)；与模型组相比，AV组和PAP-1组大鼠血清CHO水平显著降低(P<0.01)，见图3。

2.3 PAP-1对AS大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平影响

模型组大鼠较对照组血清炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著上升(P<0.01)；而PAP-1或AV干预显著降低血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平(P<0.01)，见图4。

2.4 PAP-1对AS大鼠颈主动脉MSR1和ABCA1蛋白表达影响

与对照组相比，模型组大鼠颈主动脉MSR1蛋白表达显著升高(P<0.01)，ABCA1表达显著下降(P<0.01)；与模型组相比，PAP-1干预可以逆转AS大鼠颈动脉上调的MSR1和下调的ABCA1的蛋白表达(P<0.01)，见图5。

注：与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01。¯

注：与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01。¯

注：与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，

2.5 PAP-1对AS大鼠心脏形态和功能影响

超声心动图结果显示，大鼠经球囊损伤联合高脂喂养之后左心室壁厚度增加，表现为：与对照组大鼠相比，模型组大鼠LVAWs增加(P<0.05)，LVAWd增加(P<0.01)。与模型组相比，PAP-1可以减轻AS所致的大鼠心脏左室壁厚度增加，表现为LVAWs减小(P<0.01)、LVAWd降低(P<0.05)。值得注意的是，PAP-1阻止了AS导致的心功能下降趋势，使心脏恢复到对照组水平。LVPWs与LVPWd在各组大鼠比较中没有统计学差异，见表1。

表1 大鼠超声心动图参数

2.6 PAP-1对AS大鼠心肌细胞大小影响

WGA荧光染色观察各组大鼠心肌细胞，绿色荧光指示心肌细胞膜，蓝色荧光指示心肌细胞核。如图6显示，模型组大鼠较对照组明显心肌肥大，心肌细胞面积增大(P<0.05)；与模型组相比，PAP-1或AV干预后大鼠心肌肥大明显减轻，心肌细胞面积缩小(P<0.01)。

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，

2.7 PAP-1对AS大鼠心肌纤维化影响

Masson染色结果显示，正常心肌纤维呈红色，仅可见少量胶原纤维分布。与对照组相比，模型组大鼠心肌组织见大片蓝染区域，呈网状纤维结缔组织增生，提示出现明显心肌纤维化(P<0.01)；与模型组相比，PAP-1和AV干预组大鼠心肌组织中蓝染区域显著减少，提示PAP-1能降低大鼠AS引起的心肌纤维化(P<0.01)。见图7。

注：与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，

2.8 PAP-1对AS大鼠心肌Col Ⅰ和Col Ⅲ表达影响

如图8显示，正常组大鼠心脏组织中Col Ⅰ和Col Ⅲ微量表达，模型组大鼠Col Ⅰ和Col Ⅲ阳性颗粒在心肌纤维异常沉积(P<0.01)；与模型组相比，PAP-1组和AV组Col Ⅰ和Col Ⅲ阳性颗粒的表达显著减少(P<0.01)。

注：与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01。×400。¯

3 讨论

机体在生理情况下，动脉血液中的巨噬细胞相对较少；血管内皮损伤后，血液中的单核细胞穿过内皮间隙进入血管内膜，在内膜下转化为巨噬细胞，以清除侵入内膜下的脂质。而当血脂代谢紊乱时，巨噬细胞吞噬大量氧化的低密度脂蛋白，并降解形成泡沫细胞，最终释放堆积形成粥样斑块[25]。当前，AS的治疗主要包括抑制脂质流入和促进脂质流出两方面。其中，临床目前以他汀类药物为主抑制脂质流入，通过抑制HMG-CoA还原酶，降低胆固醇的生物合成[26]，因此本实验选择AV作为阳性药物。

AS发生发展过程中，MSR1介导的巨噬细胞脂质内吞和ABCA1介导的游离胆固醇转运外排失衡[27]。本研究通过球囊损伤联合高脂饮食建立AS大鼠模型，发现模型组大鼠颈动脉内膜厚度增加，血清CHO含量升高，MSR1表达上调，ABCA1表达下调。PAP-1可以减轻AS大鼠颈动脉病理症状，降低血清血脂含量，抑制MSR1和上调ABCA1表达。炎症被认为是AS发展的关键因素之一[21]，本研究发现PAP-1可以抑制AS大鼠血清炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的异常升高。

AS是诱发多种心血管疾病的病理基础，导致心脏扩张、心功能障碍和心肌结构损伤[28]。早期防治以抑制AS的病变形成，也是目前心血管疾病领域的研究热点。本研究发现AS大鼠左室心肌细胞肥大、左室壁增厚，PAP-1干预显著减轻上述心脏病理性改变。心肌纤维化是因纤维细胞异常增生和胶原蛋白过度积累所致。在AS的进展过程中，各种致病因素导致心肌胶原代谢紊乱，阻碍血管扩张及血流增加，造成心肌缺血、缺氧甚至坏死，引发严重的心肌纤维化[29]。Col Ⅰ和Col Ⅲ的过度分泌与蓄积是导致心肌纤维化和心功能障碍的重要因素[30]，Col Ⅰ和Col Ⅲ是心肌间质中胶原网络的主要成分，Col Ⅰ主要聚合成纤细的网络，围绕在心肌细胞之间；Col Ⅲ呈现斑块状，主要聚合成粗纤维[31]。本研究显示PAP-1可以减轻AS大鼠心肌组织纤维化程度，降低心肌Col Ⅰ和Col Ⅲ积累。

本研究中，腹腔注射PAP-1可以显著减轻AS大鼠颈动脉壁形态学改变，这与Wu等[19]报道口服PAP-1对AS大鼠的保护作用一致。但是，Wu等[19]的研究指出口服PAP-1不能降低AS大鼠血清血脂水平，本研究却发现腹腔注射PAP-1可以显著降低AS大鼠的血清CHO含量，推测可能是由于大鼠腹腔注射PAP-1的生物利用度得到改善，具体机制有待进一步研究。

综上所述，本研究表明腹腔注射PAP-1可以发挥对AS大鼠的治疗及心脏的保护作用，可能与降低大鼠血清血脂和炎症因子水平，调控MSR1和ABCA1蛋白表达，减轻AS大鼠心肌肥大和功能异常，抑制心肌纤维化和胶原积累等有关。本研究为PAP-1防治AS及AS造成的心脏损伤提供了实验依据。