基于UPLC/LTQ-Orbitrap-MS和网络药理学的桔梗治疗非酒精性脂肪肝病的机制研究

王璇，许伟辰，罗子宸，徐泳，时晨，谢彤，廖颖钊，单进军,3

(1.南京中医药大学中医儿科学研究所，江苏省儿童呼吸疾病(中医药)重点实验室，江苏 南京 210023；2.南京中医药大学附属深圳市中医院，广东 深圳 518033；3.江苏省中药高效给药系统工程中心，江苏 南京 210023)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)作为一种常见的肝脏疾病，是代谢综合征在肝脏的疾病表现，是肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病、高血压和高脂血症等相关疾病的集中反映[1-2]。NAFLD已成为21世纪全球重要的公共健康问题之一，亦是我国最常见的肝脏疾病，但尚未引起足够重视[3]。NAFLD因患病率高、低龄化发展趋势、慢性进展性成为隐源性肝硬化的重要成因，与肝癌发生有关，是肝功能衰竭的原因之一，因而临床防治价值凸显[4]。

中医学对NAFLD多从症状、病因病机等方面命名，2017年发布的《非酒精性脂肪性肝病中医诊疗专家共识意见》将其归属于“胁痛”“痞满”“肝胀”“痰证”“痰浊”“湿阻”“瘀证”等范畴[5]。

桔梗是药食同源的中药，《本草崇原》记载“桔梗，治少阳之胁痛”[6]；《本经》云“桔梗主胸胁痛如刀刺”[7]。现代药理研究表明，桔梗中富含的桔梗皂苷和桔梗多糖等成分具有抗氧化和消炎功效，可以通过介导小鼠的脂肪生成，抑制脂质过氧化和抗炎作用对酒精性肝炎和非酒精性脂肪性肝炎起到治疗作用[8]。

网络药理学是从系统水平分析药物作用机制，通过构建药物-靶点-疾病网络来分析药物的作用机制[9]。本研究采用UPLC/LTQ-Orbitrap-MS技术及网络药理学方法预测桔梗治疗NAFLD可能的药效物质基础和作用靶点，并进行了相关实验验证，以期为后续的研究提供参考(图1)。

1 材料

1.1 仪器与试剂

LTQ Orbitrap XL型串联质谱仪(美国Thermo Fisher公司)；Ulti Mate 3000型超高效液相色谱(美国Thermo Fisher公司)；MJ mini梯度PCR仪(德国Eppendorf公司)；DMIL倒置显微镜(德国Leica公司)；高脂饲料(Research Diets D12492)；甘油三酯(TG)试剂、总胆固醇(TC)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；甲醇(色谱纯，美国Supelco公司)，水为超纯水。

1.2 数据库及软件

Xcalibur 2.1 SP1数据处理系统(美国Thermo Fisher公司)，Mass Frontier 7.0软件，TCMSP数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)，Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，Swiss Target Prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)，OMIM数据库(https://omim.org/)，Disgenet数据库(https://www.disgenet.org/)，TTD数据库(http://db.idrblab.net/ttd/)，String数据库(https://string-db.org/)，Venny2.1在线软件作图工具平台(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，Cytoscape 3.7.2软件，R3.6.1软件等。

1.3 实验动物

雄性C57BL/6J小鼠18只，8周龄，体质量20～25 g，由北京维通利华有限公司提供，于南京中医药大学动物中心SPF级动物饲养房适应性饲养1周，温度(22±2)℃，湿度(75±5)%，清洁饮水，昼夜控制各12 h。所有动物实验设计和方案均获得南京中医药大学动物伦理委员会同意和批准(伦理批号：202005A001)。

图1 研究设计流程图

2 方法

2.1 桔梗水提液制备

桔梗10 g,加水200 mL,浸泡1 h后煎煮2 h，取药液进行减压浓缩(75 ℃)，药液体积浓缩至原有的1/3，加入95%乙醇，调节药液乙醇浓度为70%，于4 ℃冰箱内静置24 h后去除沉淀，药液在45 ℃下减压浓缩回收乙醇后，-80 ℃保存备用。

2.2 桔梗水提液化学成分分析

2.2.1 色谱条件 色谱柱：AccucoreTMC18(150 mm×2.1 mm,2.6 μm,美国Thermo Fisher Scientific公司)，流动相：A(0.1%甲酸水溶液)-B(0.1%甲酸乙腈溶液)，梯度洗脱条件：0～1 min，21%B；1～9 min，21%→23%B；9～15 min，23%B；15～25 min，23%→23.5%B；25～28 min，23.5%→40%B；28～29.5 min，40%→90%B;29.5～31 min，90%B;31～32 min，90%→21%B;32～35 min，21%B；流速：0.3 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：1 μL。

2.2.2 质谱条件 LTQ Orbitrap XL型串联质谱仪，采用正/负离子检测模式的ESI电离方式，m/z采集范围为120～1 600，采集时间为0～35 min。主要质谱参数：毛细管温度300 ℃，蒸发器温度300 ℃，鞘气275 kPa，辅助器104 kPa，喷雾电压3.5 kV，源电流100 μA，毛细管电压35 V，管状透镜电压100 V。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密移取“2.1”项下桔梗水提液1 mL,加入9 mL甲醇稀释混匀后，超声10 min,静置过夜，隔天于18 000 r/min离心5 min,取上清，备用。

2.2.4 桔梗水提液化学成分的表征 根据UPLC/LTQ-Orbitrap-MS分析得到桔梗提取物总离子流图。根据总离子流图所得到的化合物精确分子量、二级碎片信息，和相关文献相比对，获得主要成分信息。

2.3 网络药理学分析

2.3.1 桔梗活性成分的筛选 在TCMSP数据库中设定生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18，对桔梗的活性成分进行筛选，结合“2.2.4”质谱分析得到的结果，确定桔梗的潜在活性成分，录入Pubchem数据库获得上述成分的SDF结构，导入Swiss Target Prediction数据库，取预测得分大于0的靶标作为药物靶点，整合去重后即得桔梗活性成分的对应靶点。

2.3.2 非酒精性脂肪肝疾病靶点的筛选 以“nonalcoholic fatty liver disease”“non-alcoholic fatty liver disease”为关键词，分别在OMIM、Disgenet、TTD数据库进行检索。

2.3.3 绘制网络图和PPI图 使用Cytoscape 3.7.2软件，构建药物-成分-靶点-疾病网络图，使用Network Analyzer功能对桔梗的主要活性成分进行分析。将上述药物-疾病共同靶点输入到String数据库中进行检索，设置蛋白种类为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值为0.4，构建蛋白相互作用的PPI网络。将PPI网络导入Cystoscape 3.7.2中，通过Network Analyzer工具进行拓扑分析，以Degree,Betweenness centrality,Average shortest path length和Closeness centrality这4个参数为参考标准，筛选出核心靶点。

2.3.4 富集分析 为了对靶基因的功能进行描述和注释，以及探究其作用的信号通路。基于R软件使用Bioconductor生物信息软件包以P<0.05，Q<0.05进行关键靶基因GO与KEGG功能富集分析，并将结果以气泡图形式输出。GO富集分析包括分子功能(Molecular function，MF)、生物学过程(Biological process，BP)、细胞学组分(Cellular components，CC)3个部分。进行KEGG富集分析，筛选出桔梗治疗NAFLD的潜在作用信号通路。

2.4 实验验证

2.4.1 动物实验 18只雄性C57BL/6J小鼠随机分为空白组、模型组和桔梗组，每组6只，空白组给予正常饲料，模型组给予高脂饲料，桔梗组给予高脂饲料的同时水饲桔梗水提液(合生药量4.5 g/kg)，连续喂养12周后，颈椎脱臼处死。

2.4.2 小鼠肝脏病理学观察与生化指标检测 小鼠给药12周后，颈椎脱臼处死小鼠,迅速摘取肝脏新鲜组织，根据TG、TC试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20210612，20210611)说明书进行操作。一部分肝脏固定于4%多聚甲醛溶液中，制备石蜡切片。

2.4.3 小鼠肝脏mRNA水平 采用qPCR检测肝组织TNF、MAPK3、AKT1 mRNA的表达，以2-ΔΔCt值表示基因相对表达量。引物信息见表1，引物由上海生工生物技术有限公司合成。

2.5 统计学分析

表1 引物序列

3 结果

3.1 桔梗的化学成分分析及吸收预测

采用UPLC/LTQ-Orbitrap-MS技术对桔梗的化学成分进行定性分析，根据化合物的一级、二级质谱信息，结合Xcalibur软件的精确相对分子质量数，对照品的标准图谱以及相关文献[10-11]，并结合Mass Frontier 7.0软件进行碎裂辅助推断和验证，对桔梗提取物图谱(图2)中主要表征出的化学成分进行鉴定，将得到的化学成分根据Lipinski类药五原则，利用Molinspiration网站进行生物利用度预测，结果发现6个成分均可能被吸收(表2)。桔梗的主要成分为三萜皂苷类，这些成分在正、负离子模式下均有较好响应；桔梗在正、负离子模式下色谱峰基本上是一致的，因此，本文只选择了在负离子模式下的TIC进行分析。

图2 桔梗水提液在负离子模式下的TIC

表2 负离子模式下部分化合物的鉴定

3.2 网络药理学分析结果

3.2.1 桔梗活性成分 以OB≥30%，DL≥0.18%作为活性成分筛选条件，得到7个活性成分，再与3.1中定性分析得到的成分进行综合分析，共获得13个活性成分，分别是Dihydroquercetin、Spinasterol、Dimethy 2-O-methyl-3-O-α-D-glucopyranosyl platycogenate A、Luteolin、Acacetin、Platycodin A、2-O-Methyl-3-O-beta-D-glucopyranosyl platycogenate A、Platycodin D、Robinin、Platycodin C、Deapio-platycodin D、Platycoside E、Platycoside H/Platycinic acid A。其中OB反映药物进入人体循环的药量比例，描述口服药物由胃肠道吸收后经过肝脏到达体循环血液中的药量占口服剂量的百分比，DL指化合物与已知药物的相似性。

3.2.2 桔梗活性成分治疗NAFLD公共靶点 经过数据库筛选共获得桔梗相关靶点278个，NAFLD相关靶点1 536个，在Venny 2.1在线软件作图工具平台上输入上述靶点，绘制韦恩图，两者取交集后获得药物-疾病共同靶点83个(图3)。

图3 桔梗治疗NAFLD潜在靶点的韦恩分析

3.2.3 PPI网络的构建及核心靶点筛选 将上述药物-疾病共同靶点输入到String数据库中进行检索，设置蛋白种类为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值为0.4，构建蛋白相互作用(PPI)网络(图4)。

图4 交集基因PPI网络图

将PPI网络导入Cystoscape 3.7.2中，通过Network Analyzer工具进行拓扑分析，以Degree, Betweenness centrality, Average shortest path length和Closeness centrality这4个参数为参考标准，通过Degree排序，选取分值大于平均分的基因作为核心靶点，将前30个靶点使用R 3.6.1绘制条形图(图5)。核心靶点信息见表3。

图5 基于PPI拓扑分析的核心靶点排序(排名前30)

表3 核心靶点信息

(续表)

3.2.4 GO富集分析 将83个共同靶点经R语言运行后GO分析选取MF、BP、CC3部分(图6A)。GO结果显示，交集基因集合共富集到1 642条BP通路，46条CC表达过程，85个与MF相关的过程。

债券市场的发展使得各个国家都开始正视营销业务开展的问题，中国债券市场发展热点问题这一新兴的金融活动营运而生，并且迅速在我国中国债券市场落地生根。然而由于债券市场的发展时间较短，我国资本市场对于中国债券市场的认识有限，对于其广阔债券市场的发展前景也未能进行有效的调研。因此，在目前我国的中国债券市场业务中，涉及到中国债券市场发展热点问题这一板块的业务还非常少，债券市场的发展经验和长期债券市场的发展计划限制了中国债券市场营销在中国中国债券市场的普及。导致现有的中国债券市场营销业务拓展不足，业务拓展模式单一。

3.2.5 KEGG富集分析 将83个共同靶点经R语言运行后共得到141条KEGG通路，前20的结果形成KEGG功能富集的气泡图(图6B)，P值代表富集的显著性，颜色越红则显著性越高。KEGG结果显示PI3K-AKT信号通路、TNF信号通路、PPAR信号通路和MAPK信号通路等与非酒精性脂肪肝关系密切。见图7。

图6 富集分析结果

图7 潜在活性成分-靶点-通路网络图

3.3 桔梗对NAFLD小鼠模型的影响

3.3.1 小鼠肝脏病理学观察 HE染色结果显示(图8A)，光镜下可见空白组小鼠肝脏切片细胞形态规则，细胞质均匀，细胞核清晰，无脂肪滴；模型组肝细胞排列紊乱，细胞膨胀，部分细胞核破损，出现空泡气球样变及脂质沉积；与模型组相比，桔梗组细胞质、核清晰可见，未见空泡样变性、细胞坏死，肝细胞受损情况明显好转。

3.3.2 小鼠肝脏生化指标检测 检测小鼠肝脏中TC、TG含量(图8B)，与空白组比较，模型组小鼠肝脏TG水平显著升高(P<0.01);与模型组比较，桔梗组小鼠肝脏TG水平显著降低(P<0.05)。各组小鼠肝脏中TC水平变化趋势与TG一致，但没有统计学差异(P>0.05)。

注：与空白组比较，**P<0.01；与模型组比较，图8 小鼠肝脏HE染色及TC、TG含量

3.3.3 小鼠肝脏中靶基因表达 通过qPCR检测网络药理学富集分析结果中通路关键靶点基因表达情况，选取排名靠前的3个靶基因进行实验。与空白组相比，模型组小鼠肝脏MAPK3和AKT1 mRNA表达水平显著上升(P<0.01);与模型组相比，桔梗组小鼠肝脏MAPK3和AKT1 mRNA表达水平显著下降(P<0.05)。小鼠肝脏中TNF mRNA表达水平变化趋势与MAPK3和AKT1 mRNA一致，但差异无统计学意义(P>0.05)。见图9。

注：与空白组比较，**P<0.01，***P<0.001；与模型组比较，

4 讨论

NAFLD是肝功能异常和慢性肝病最常见的原因，成人NAFLD患病率约为20%～33%。随着全球肥胖症和代谢综合征人数日益增长，亚洲国家近20年来NAFLD增长迅速且呈低龄化发病趋势[12-14]。研究表明，到2030年，中国NAFLD患者总数将增至3.145 8亿，是全球患病率增长最快的国家[15]，这必将给我国健康医疗服务带来沉重负担。遗憾的是，现代医学目前对NAFLD的治疗尚无特效药物[16]。

研究发现药食同源的桔梗对多种药物性肝损伤模型都有治疗作用[17]。桔梗水煎液可以抑制四氯化碳导致的肝脏毒性，其机制与清除氧自由基相关[18]；水煎液还能减轻四氯化碳诱导的肝纤维化，其机制主要是激活肝星状细胞[19]；桔梗根部分离的皂苷可以保护由过氧化叔丁醇造成的肝毒性，与其清除氧自由基和保护细胞免受氧化应激反应有关[20]；桔梗水提物能保护由乙酰氨基酚引起的肝损伤，与阻断肝药酶对乙酰氨基酚的生物激活相关[21]。

本研究基于拓扑参数分析发现桔梗皂苷D(Platycodin D)、木犀草素(Luteolin)、金合欢素(Acacetin)、二氢槲皮素(Dihydroquercetin)等可能为桔梗水提物治疗NAFLD的重要活性成分。桔梗皂苷D通过激活SIRT1和CaMKKβ/AMPK信号通路，抑制SREBP-1c的表达来抑制脂肪的生成[22]。木犀草素能通过抑制JNK磷酸化，降低肝细胞氧化应激，保护线粒体功能，抵抗DNA断裂诱发细胞凋亡，从而达到保护过量对乙酰氨基酚导致的肝细胞损伤以及高脂饲料诱导的肝脏脂肪变性[23-24]。金合欢素能明显上调肝细胞和肝组织中转录因子SREBP-2的蛋白水平，改善肝细胞脂质代谢[25]。此外，金合欢素还可以增强大鼠肝组织匀浆和血浆中谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶的活性，可以显著清除DPPH自由基，有效减弱体外的脂质过氧化反应，从而达到治疗肝损伤的目的[26]。二氢槲皮素可以通过抑制Caspase-3、Caspase-7和Caspase-8的活化来保护HepG2细胞免受TNF-ot/ActD诱导的细胞凋亡[27]；可以通过调节酶活和减少活性氧的积累来改善机体氧化，激活LKBl基因的表达，增强AMPK磷酸化来调节胆固醇调节元件结合蛋白SREBPl和ACC的表达[28]；还可以上调SIRTl(负责去乙酰化)的表达，下调P2X7R(负责促炎因子的合成与释放)和NLRP3等转录因子的表达，从而起到抑制脂肪生成和保肝的功效[29]。

NAFLD发病机制非常复杂，其进展可能涉及“平行多次打击”损伤的发生，其特征是氧化应激诱导的线粒体功能障碍，目前认为高脂饮食、胰岛素抵抗、氧化应激、炎症介质和细胞因子是重要诱因[30-31]。其中胰岛素是调控机体内部糖与脂类代谢的重要激素，胰岛素抵抗被认为是发生NAFLD和代谢综合征的中心环节[32]。

富集分析发现PI3K/AKT是桔梗抗NAFLD最相关的信号通路。确实，PI3K/AKT作为传递胰岛素信号的关键通路，通过调控胰岛素水平参与体内的糖脂代谢。而各种因素导致的PI3K/AKT信号传导障碍，均可引起胰岛素抵抗，从而促进NAFLD的发生与发展[33]。研究资料表明[34]，人体内的胰岛素主要通过PI3K-AKT信号通路来维持糖脂代谢的平衡。胰岛素是在胰岛β细胞刺激下分泌的一种激素，它能调控机体内的糖脂代谢，从而维持平衡。机体内的胰岛素到达作用的组织器官后，首先与胰岛素受体(InsR)的α亚基结合，诱导β亚基的酪氨酸蛋白激酶(PTK)被激活，随后PTK又使InsR的底物磷酸化，继而活化它的催化亚基p110，随后生成PIP3，与PDK1结合并激活3种已知的AKT异构体，AKT被激活后从质膜上释放出来，转移到胞核、胞质和线粒体中[35]。

综上所述，本研究基于UPLC/LTQ-Orbitrap-MS技术对桔梗水提物中化学成分进行鉴定，结合网络药理学方法预测桔梗治疗NAFLD的主要化学成分和潜在作用机制，充分体现了桔梗多成分、多靶点、多通路的系统调控特点；同时通过体内实验对网络药理学富集分析得到的排名前3的关键靶基因TNF、MAPK3、AKT1做了初步验证，为进一步探讨桔梗治疗NAFLD的物质基础和作用机制提供一定参考依据。