参附注射液对氧化应激血管内皮损伤及相关信号转导通路的影响

陈瑞娟，吴坚，田芳，孔祥清，芮庆林

(1.南京中医药大学附属医院/江苏省中医院,江苏 南京 210029；2.南京医科大学第一附属医院，江苏 南京 210029)

脓毒症是各种感染导致机体出现反应失调，进而引发多器官功能障碍乃至危及生命的常见急危重症，其发病率和死亡率都高，是现代急诊与重症医学领域的重要研究方向[1]。

血管内皮细胞是循环血液和血管之间的屏障,参与炎症、凝血、免疫反应、血管张力调节等重要生物过程，血管内皮损伤或功能障碍被认为是脓毒症发生发展的核心环节[2-3]。作为病原体及毒素攻击的主要靶标，内皮细胞被过度刺激后产生大量血管活性物质，可致内皮损伤乃至凋亡，引起器官功能障碍[4-5]。氧化应激与内皮损伤密切相关，疾病状态下活性氧(ROS)含量增加,氧化脂质生成丙二醛(MDA)，后者进一步促进氧化应激导致恶性循环，严重破坏内皮功能。

参附注射液具有回阳救逆、益气固脱的功效，被广泛应用于脓毒症休克、失血性休克和心肺复苏的临床救治中，疗效确定[6-7]。氧化应激损伤是脓毒症、心脏骤停等多种疾病共存的病理基础[8-9]。既往研究显示参附注射液具有拮抗氧化应激内皮损伤的作用[10]，但具体作用机制尚未完全明确。

本研究制备血管内皮细胞氧化应激损伤模型，观察参附注射液对血管内皮细胞ECV304氧化应激和凋亡的影响，并探讨可能涉及的信号转导通路，以期明确参附注射液保护血管内皮的作用机制。

1 材料

1.1 实验对象

血管内皮细胞ECV304购自中国科学院上海细胞生物学研究所。

1.2 主要试剂

参附注射液(批号：16110701002)购于华润三九雅安药业有限公司；H2O2、N-乙酰半胱氨酸(NAC)购于国药集团化学试剂有限公司；胎牛血清、1640培养基购于美国Gibco公司；噻唑蓝(MTT)细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量检测试剂盒、DCFH-DA荧光探针ROS检测试剂盒购于南京建成生物工程有限公司；异硫氰酸荧光素酯(FITC)标记的Annexin V、碘化丙啶(PI)购于上海碧云天生物技术研究所；Hoechest33258，GAPDH、Cleaved Caspase-3(C-Caspase-3)、Bcl-2和Bax抗体购于美国Sigma公司；ERK和p-ERK单克隆一抗，辣根过氧化物酶标记的二抗购于美国Santa Cruz公司。

1.3 主要设备

SW-CJ-1F超净工作台(苏州净化集团安泰公司)；Forma CO2培养箱(美国Thermo Scientific公司)；超声波细胞裂解仪(苏州珀西瓦尔实验设备有限公司)；多功能酶标仪(美国Thermo Fisher公司)；ZE5流式细胞仪、Trans-Blot Turbo蛋白转印系统、电泳仪(美国Bio-Rad公司)；化学发光及凝胶成像系统(英国Syngene公司)。

2 方法

2.1 血管内皮细胞ECV304的培养

将血管内皮细胞ECV304置于含10%胎牛血清的1640培养基中，在37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，取对数期生长细胞用于实验。

2.2 细胞分组和处理

2.2.1 MTT实验 将培养的ECV304细胞分为对照组和H2O225、50、100、150、200、250、300 μmol/L组。H2O2作用3 h后检测细胞存活率，根据结果筛选出H2O2的最佳造模浓度。

将培养的ECV304细胞分为对照组和参附注射液5、10、15、20、30、40、60 μL/mL组。参附注射液干预12 h后检测细胞存活率，根据结果评估参附注射液的安全浓度范围。

将培养的ECV304细胞分为对照组，H2O2组和H2O2+参附注射液5、10、15、20、30、40、60 μL/mL组。H2O2作用3 h，根据前面的MTT结果选择造模浓度。参附注射液预孵12 h，根据结果筛选参附注射液的最佳干预浓度。

2.2.2 其余实验 将培养的ECV304细胞分成4组：①对照组；②H2O2组；③H2O2+参附注射液组；④H2O2+NAC组。参附注射液(根据MTT选择干预浓度)预处理12 h或NAC(500 μg/mL)预孵1 h后，加入H2O2(根据MTT选择造模浓度)作用于ECV304细胞3 h，然后进行各项检测。

2.3 检测方法

2.3.1 MTT检测 取对数生长期ECV304细胞，将细胞悬液调整为1×105mL-1接种于96孔板中，5%CO2，37 ℃环境培养24 h，暴露于不同浓度梯度的H2O2(0、25、50、100、150、200、250、300 μmol/L)中培养3 h或者不同浓度梯度的参附注射液(5、10、15、20、30、40、60 μL/mL)中培养12 h(每组设6个复孔)后，每孔加20 μL MTT(5 mg/mL)，5%CO2，37 ℃环境孵育4 h，吸弃上清后每孔加150 μL DMSO振荡10 min，同时设置调零孔，在酶标仪490 nm处检测各孔吸光值。

将不同浓度梯度的参附注射液(5、10、15、20、30、40、60 μL/mL)预孵ECV304细胞12 h，按照筛选出的最佳H2O2浓度造模3 h，后续步骤同上检测各孔吸光值。

2.3.2 Hoechst染色 在6孔细胞培养板内放入洗净的盖玻片；收集对数生长期细胞，将细胞悬液调整为1×105mL-1接种于上述处理过的6孔培养板中，培养至50%～80%；实验组予以参附注射液(5 μL/mL)预处理12 h或NAC(500 μg/mL)预孵1 h后，加入300 μmol/L的H2O2作用于ECV304细胞3 h,吸弃上清，加0.5 mL 4%多聚甲醛固定10 min；吸弃固定液；磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗2遍；加0.5 mL Hoechst33258染色液(5 mg/L)振荡5 min；再用PBS洗2遍；在载玻片上加1滴抗荧光淬灭封片液，将贴有细胞的盖玻片放在载玻片上，室温晾干，荧光显微镜观察拍摄相应照片。实验重复3次，取阳性细胞百分比的均值作为阳性细胞率值。

2.3.3 DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS含量 PBS洗涤细胞(1 000 r/min离心5 min)1次后收集并调整细胞浓度为1×106mL-1；用无血清培养液稀释DCFH-DA(1∶1 000)，使终浓度为10 μmol/L；细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，37 ℃细胞培养箱内孵育20 min，每隔3～5 min颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触；用无血清细胞培养液洗涤细胞3次以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA；流式细胞仪检测细胞内ROS含量。实验重复3次。

2.3.4 流式细胞术检测细胞凋亡 按Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书步骤，取100 μL单细胞悬液(含1×106个细胞)，加入100 μL Binding buffer和5 μL FITC标记的Annexin V(20 μg/mL),室温下避光培养30 min，再加入50 μg/mL PI 5 μL，避光培养5 min，加入400 μL Annexin V binding solution，用流式细胞仪进行细胞的定量检测，同时以Annexin V-FITC+PI作为阴性对照，实验重复3次，分析软件Cell Quest检测细胞的平均荧光强度。

2.3.5 Western blot检测 按BCA法蛋白定量试剂盒说明书测定样本蛋白浓度。取100 μg样品，使用6%SDS-PAGE胶进行蛋白分离；通过电泳仪将分离后的蛋白电转至PVDF膜上。5%脱脂奶粉室温下封闭1 h，用含Tween20的Tris缓冲盐溶液(TBST)稀释一抗C-Caspase-3、ERK、p-ERK、Bcl-2、Bax和内参GAPDH。4 ℃过夜，TBST洗膜3次，加Tris缓冲盐溶液稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗,37 ℃反应1 h,TBST溶液洗膜3次.用电化学发光剂进行显影定影,Gel-Pro软件分析各检测蛋白条带的吸光度，实验重复3次，得出灰度的平均值作为蛋白含量值。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 各组MTT检测结果比较

随着H2O2的浓度递增，ECV304细胞的存活率逐步减少并呈线性关系(P<0.05，P<0.01)；不同浓度梯度的参附注射液对ECV304细胞的存活率无显著影响；选择300 μmol/L H2O2制备ECV304细胞氧化应激模型，用不同浓度梯度参附注射液进行干预，5 μL/mL参附注射液的作用浓度最低且保护作用强。见图1。

注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与H2O2组相比，图1 H2O2和H2O2+参附注射液对ECV304细胞存活率的影响

3.2 各组Hoechst染色结果比较

与对照组比较，H2O2组细胞凋亡增多(P<0.05)；与H2O2组比较，参附注射液或NAC能减少H2O2诱导的细胞凋亡，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

注：与对照组比较，**P<0.01；与H2O2组比较，图2 参附注射液对H2O2诱导ECV304细胞凋亡Hoechst染色和阳性细胞率的影响

3.3 各组流式细胞检测结果比较

与对照组比较，H2O2组ECV304细胞凋亡显著增加(P<0.05);与H2O2组比较，参附注射液或NAC能减少H2O2诱导的ECV304细胞凋亡，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

对照组 H2O2 H2O2+参附注射液 H2O2+NAC

注：与对照组比较，**P<0.01;与H2O2组比较，

3.4 各组细胞内ROS含量比较

与对照组相比，H2O2组细胞内ROS含量显著增加(P<0.05)；与模型组相比，参附注射液或NAC能降低ROS的含量，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

注：与对照组比较，**P<0.01；与H2O2组比较，

3.5 各组Western blot检测结果比较

与对照组比较，H2O2能够增加Cleaved Caspase-3、p-ERK的表达(P<0.05)，降低Bcl-2/Bax比值(P<0.05)；参附注射液或NAC能拮抗H2O2诱导的ERK磷酸化，上调Bcl-2/Bax，减少C-Caspase-3表达，差异有统计学意义(P<0.05)。见图5。

注：与对照组比较，**P<0.01；与H2O2组比较，

4 讨论

参附注射液源于传统中医古方参附汤，由人参、附子2味中药经现代生产工艺提取而成。参附汤是益气温阳的代表方，人参大补元气，附子大辛大热，两药相得益彰，具有温阳益气的作用。临床研究显示参附注射液可以改善脓毒症患者的预后和器官功能[11-12]，基础实验表明参附注射液可拮抗H2O2诱导的内皮细胞凋亡[13]，但具体作用机制尚不明确。

血管内皮与平滑肌细胞是炎症反应的靶细胞及效应细胞,其结构和功能异常在微循环障碍、脓毒症休克及多器官功能损伤中起着重要作用[14]。临床研究显示血管内皮细胞损伤与脓毒症休克患者的预后密切相关[15]。细胞凋亡是由基因控制的细胞自主有序的死亡，凋亡失调参与多种疾病的发生发展过程。内皮细胞凋亡可致微循环障碍进而引发多器官功能不全。本研究中MTT结果显示H2O2能诱导ECV304细胞死亡，且随着H2O2浓度递增，细胞的存活率逐渐减少，并与浓度呈线性关系。选择300 μmol/L H2O2制备氧化应激损伤模型，在不同浓度参附注射液干预下观察细胞存活率，发现5～60 μL/mL参附注射液对ECV304细胞具有显著保护作用(P<0.05，P<0.01)，最终我们选择作用显著且浓度较低的5 μL/mL作为参附注射液的实验干预浓度，与既往的研究结果相近[13]。Hoechst染色和流式细胞仪检测结果皆显示参附注射液或ROS清除剂NAC能减少H2O2诱导的ECV304细胞凋亡，提示参附注射液可能通过减少氧化应激损伤保护血管内皮。

ROS是诱导细胞凋亡的重要因子，机制包括：①诱导线粒体通透性转换孔开放；②激活丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPKs)家族的JNK和P38诱导细胞凋亡；③通过JNK通路拮抗细胞凋亡；④激活促凋亡蛋白Bax，抑制抗凋亡蛋白Bcl-xl；⑤氧化NF-κB的P50亚基导致其与DNA的结合能力减弱，进而抗凋亡能力减弱[16]。本研究显示H2O2可增加ECV304细胞ROS的含量，参附注射液或NAC可降低H2O2诱导的ROS含量变化，提示参附注射液和NAC均具有抗氧化应激、减少ROS的作用。既往研究显示参附注射液能减少氧化应激水平,保护肾脏缺血再灌注损伤[17]，同样提示参附注射液具有拮抗氧化应激损伤的作用。

凋亡是多基因严格控制的过程，其涉及的信号转导通路错综复杂，相互交织。Caspase家族为细胞凋亡的关键酶，其中Caspase-3是多种凋亡信号转导途径共同的终末执行分子。未激活的Caspase-3通常以酶原(32 kD)形式存在于细胞胞浆中，被激活后变成2个大亚基(17 kD)和2个小亚基(12 kD)，剪切后的C-Caspase-3具有裂解胞浆胞核底物的活性，能够导致细胞凋亡。本研究结果显示，与对照组比较,H2O2组被激活的Caspase-3(C-Caspase-3)的表达增多，而参附注射液或NAC能拮抗H2O2诱导的C-Caspase-3表达增加，提示二者可通过减少Caspase-3的活化拮抗H2O2诱导的ECV304细胞凋亡。

Bcl-2和Bax同属于Bcl-2蛋白家族，Bcl-2属于膜整合蛋白，能阻止线粒体释放细胞色素C，进而抑制细胞凋亡、促进细胞存活，是细胞凋亡信号转导通路中重要的抗凋亡蛋白。Bax是促凋亡蛋白，它通过与Bcl-2形成同源或异源二聚体来调节细胞凋亡,当Bax-Bax形成同源二聚体时细胞发生凋亡，而Bax-Bcl-2形成异源二聚体时能抑制细胞凋亡，完成对细胞的调控[18]。本实验结果显示H2O2能增加ECV304细胞Bax的表达，减少Bcl-2的含量，降低Bcl-2/Bax比值。参附注射液或NAC能拮抗H2O2诱导的上述变化，提示二者可能通过调控Bcl-2/Bax比值参与H2O2诱导ECV304细胞凋亡的调节。

ERK属于MAPKs家族，是Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的重要组成部分。ERK能够被磷酸化激活，进而介导胞浆和胞核间的信号传递，参与细胞的增殖、分化、凋亡和癌变等多种病理生理过程[19]。ERK信号通路对凋亡具有双向调节作用，细胞和疾病类型不同，ERK的作用不尽相同[20-21]。本实验结果显示，与对照组比较，H2O2刺激后p-ERK的表达增多，提示ERK通路参与H2O2诱导的ECV304细胞凋亡；参附注射液或NAC能减少H2O2诱导的ERK和Caspase-3的活化，提示参附注射液可能通过抑制ERK信号通路活化，拮抗氧化应激诱导的ECV304细胞凋亡。

综上所述，参附注射液可能通过减少ROS的产生，抑制ERK信号通路活化，进而调节Bcl-2/Bax比值，拮抗氧化应激诱导的ECV304细胞凋亡。中药方剂常表现为多靶点效应，后续研究可积极探讨参附注射液是否对靶器官具有直接的保护作用。