GINS家族基因在肾透明细胞癌中的表达特点及预后价值

钟方炎，邓剑雄，赖军明，沈若妍，林 红，罗 辉

(1.南昌大学第一附属医院肿瘤科，南昌 330006； 2.义乌市中心医院放射治疗中心，浙江义乌 322000； 3.浙江中医药大学第二临床医学院，杭州 310013)

肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是男性第六大最常被诊断的癌症，女性第十大最常被诊断的癌症，分别占所有肿瘤诊断的5%和3%[1]。RCC有多种组织学亚型，每种亚型都具有独特的分子格局，其中最常见的为肾透明细胞癌(clear cell RCC，ccRCC)，其可占到所有病例的75%，转移后的ccRCC患者预后较差，诊断后5年总体生存率(overall survival，OS)不到10%[2]。目前对于ccRCC患者的治疗首选手术切除，其他治疗包括雷帕霉素哺乳动物靶标抑制剂，抗血管生成药物(血管内皮生长因子抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂)，免疫治疗药物(比如：细胞程序性死亡受体1/细胞程序性死亡配体1抑制剂)等[3-6]，虽然ccRCC的治疗手段取得了一定的进展，但ccRCC患者的OS并没有显著增加。故发现新的治疗手段，探索新的药物靶向治疗位点以及发现可以判断ccRCC预后的新标志物仍旧是研究者们的工作重点。

GINS复合物由四种蛋白质组成(Sld5-Psf1-Psf2-Psf3)，分别对应GINS4、GINS1、GINS2、GINS3基因，GINS复合体是真核生物建立DNA复制叉和复制体发展的基础，其为真核生物复制解旋酶的核心成分之一，在DNA复制开始时，GINS复合物启动环状结构，调控多功能蛋白、生长因子信号、受体分子等，参与DNA复制和细胞周期进展的启动[7]。既往研究[8-9]发现，GINS家族基因的异常表达能够促进癌症的发生发展并提示疾病的预后，比如GINS4可以通过激活Rac1和CDC42促进胃癌细胞的生长和进程，GINS1的高表达可能与激素受体阳性乳腺癌预后不良有关。然而GINS家族基因在ccRCC中的作用并不清楚，故在本研究中，通过运用生物信息学技术，探索GINS家族基因在ccRCC中的表达、突变及临床预后相关性，此外还分析了GINS突变的ccRCC患者中差异表达量最高的50个基因，并结合GINS家族基因进行了功能和通路分析。

1 材料和方法

1.1 ONCOMINE数据库分析

ONCOMINE一个用于DNA或RNA序列分析的综合在线癌症微阵列数据库(www.oncomine.org)，旨在促进从全基因表达分析的研究发展[10]。在此项研究中，采用t检验比较转录表达的差异;设定检索阈值分别为P:1E-4,FC:1.5,Gene Rank Top:10%;资料类型mRNA。将GINS家族基因分别在该数据库中进行ccRCC组织和正常肾组织mRNA表达量对比。

1.2 UALCAN分析

UALCAN是一个用于分析癌症组学数据全面的、用户友好的、交互式的在线网站(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)，其数据来源主要基于癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)和MET500转录组数据[11]。使用该网站对ccRCC患者的临床病理学特征和不同GINS基因的mRNA表达量进行分析。采用t检验进行比较，P的截断值为0.05。

1.3 Kaplan-Meier plotter分析

Kaplan-Meier plotter是主要基于基因表达综合数据库(gene expression omnibus,GEO)(http://kmplot.com/analysis/)和TCGA的数据来源可对基因表达与多种癌症数据进行生存分析的网站[12]。使用该网站通过OS和无复发生存率(relapse free survival，RFS)来评估不同GINS基因的临床预后价值。进入pan-cancer界面中勾选ccRCC，通过将不同GINS基因的中位mRNA表达量将ccRCC患者分成高表达组和低表达组，通过单因素COX回归分析来评估其预后价值。

1.4 Metascape、String数据库分析及Cytoscape可视化处理

Metascape是一个集中了丰富的生物学信息，旨在提供全面的基因注释和分析资源的数据库(http://www.metascape.org/)[13]。String是一个主要用于收集、整合和评价蛋白质间作用关系并建立网络图的数据库(https://string-db.org/)[14]。利用Metascape对含有GINS家族基因突变的改变组中差异表达最高的50个基因及GINS家族基因进行基因本体论(gene oncology，GO)富集和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析。使用String(版本11.0)网站对上述基因进行蛋白质互相作用(protein-protein interaction network，PPI)网络图的勾画，并将其在Cytoscape(版本3.7.2)软件[15]中进行可视化处理。

2 结果

2.1 GINS家族基因在泛癌和ccRCC中mRNA的表达

通过上述检索条件在ONCOMINE数据库中检测20种肿瘤组织中4个GINS家族基因的mRNA表达，并与正常组织进行比较，发现GINS1、2、3均在ccRCC中呈现高表达(图1)。GINS1在肾癌中有2项数据集高表达(均为ccRCC)；GINS2在肾癌中有1项数据集高表达；GINS3在肾癌中有4项高表达(1项为ccRCC)；GINS4在肾癌中无数据集高表达。其中在Beroukhim Renal数据集中，GINS1分别在非遗传性ccRCC组和遗传性ccRCC组中与正常肾组织出现表达差异，差异倍数(fold change,FC)分别为2.354和2.467，t分别为7.117和6.393，P分别为8.91×10-8和1.62×10-7。GINS2在Beroukhim Renal数据集的非遗传性ccRCC组中出现表达差异，FC为1.837，t为5.637，P为1.10×10-6。GINS3在Jones Renal数据集的ccRCC组中出现表达差异，FC为4.324，t为20.152，P为2.58×10-23(表1)。在UALCAN网站中，通过选择样本类型，可以观察到GINS2/3/4在ccRCC组织比正常组织显著高表达(P<0.001),GINS1在ccRCC组织比正常组织高表达(P<0.05)。

A:GINS家族基因在数据集中的表达；B—E:GINS家族基因在ccRCC组织与正常肾组织中的mRNA表达。*P<0.05，***P<0.001。

表1 ONCOMINE数据库中GINS1、GINS2、GINS3 mRNA的表达量差异

2.2 临床病理学特征与不同GINS基因mRNA表达情况的相关性分析

在UALCAN网站对GINS家族基因的mRNA表达量在ccRCC患者数据中分别选择癌症分期、肿瘤分级进行分析(图2)。在癌症分期中GINS1/2/4 mRNA表达量在4期中最高，GINS3的mRNA表达量在2期中最高，其中GINS2的4期表达量与其他分期比较差异有统计学意义(P<0.05)。在肿瘤分级中GINS3/4在1级中表达最高，GINS1在3级中表达最高，其中GINS2基因在4级中表达最高，并且与其他分级比较差异有统计学意义(P<0.05)。

A：GINS家族基因表达与ccRCC癌症分期之间的关系；B:GINS家族基因表达与ccRCC肿瘤分级之间的相关性。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2.3 GINS家族基因表达与ccRCC患者生存预后的关系

将GINS家族基因在Kaplan-Meier plotter中与ccRCC患者进行OS和RFS分析(图3)。在OS曲线图中，GINS2高表达组相比于低表达组显示出较低的OS(HR=1.71,CI1.27～2.30;P=0.000 38)，其余差异无统计学意义。在RFS曲线图中，GINS家族基因差异无统计学意义。

A:不同GINS基因的高表达组和低表达组分别与总体生存率之间的关系；B:不同GINS基因的高表达组和低表达组分别与无复发生存率之间的关系。

2.4 GINS家族基因与改变组中差异表达基因的通路、功能富集及PPI网络图

对相关基因进行GO富集及KEGG通路分析，发现这些基因在细胞周期过程的调控、DNA复制涉及的DNA链延长、纺锤体微管与着丝点连接的调节、DNA构象变化、mRNA转运、减数分裂细胞周期的调控、p53类介质对信号转导的调控等方面起作用(图4A)。并将这些基因在string网站中进行绘制，去除了不相连的节点后构建了一个具有40个节点和293条边的PPI网络图(图4B)。

含有GINS家族基因突变的改变组中差异表达最高的前50个基因及GINS家族基因的通路和功能富集(A)以及其PPI网络图(B)。

3 讨论

本研究结果显示，GINS家族基因mRNA在ccRCC中均有高表达，且4个家族基因与癌症分期和肿瘤分级均有相关性，其中GINS2基因的mRNA表达随着癌症分期和肿瘤分级上升有着增加的趋势，并分别在4期和4级中达到最高。在生存分析中发现GINS2在ccRCC患者中的OS差异有统计学意义，其GINS2高表达组相比低表达组有着较低的OS。对有GINS家族基因突变的改变组中最高差异表达的50个基因及GINS家族基因进行联合分析，其中在细胞周期过程的调控、DNA复制涉及的DNA链延长及有丝分裂细胞周期转变中富集最为显著，这提示ccRCC的发生发展可能与细胞周期中相关基因有关。

GINS2基因作为GINS家族基因之一，参与多种细胞信号通路，与一系列其他受体和生长因子共同调控细胞周期和增殖[18]，并在DNA复制的起始阶段，介导Cdc45和微小染色体维持蛋白之间的互相作用[19]，而且其与DNA损伤存在联系[20]。GINS2基因在许多实体肿瘤中大量表达，与癌细胞的生长、增值、侵袭、转移关系密切，并通过参与细胞周期的调控影响多种生物学特征。YAN等[21]研究发现，相比于正常卵巢组织，GINS2的表达在上皮性卵巢癌组织中更高(16.7% vs 58.3%)，且通过GINS2基因下调可以抑制肿瘤细胞的增值和生存能力，诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡，因此GINS2可能参与了上皮性卵巢癌的发生发展。YE等[22]研究显示，GINS2通过TGF-β1来调节CITED2和LOXL2，从而促进甲状腺癌细胞的增殖和减少其凋亡。此外，在乳腺癌和非小细胞癌中GINS2也通过相关机制促进肿瘤细胞的生长和减少凋亡[23-24]，在该研究中GINS2基因的mRNA表达量随着癌症分期和肿瘤等级的上升呈现增加的趋势，且在不同分期和等级之间有统计学的差异，这可能也印证着高表达的GINS2在ccRCC中也具有促进肿瘤细胞增殖、生长和减少凋亡的能力。OUYANG等[25]发现，与正常宫颈组织相比，宫颈癌肿瘤细胞系和肿瘤标本中GINS2明显上调，GINS2的表达与鳞状细胞癌抗原(P<0.001)，深层基质浸润(P=0.021)，生命状态(P<0.001)，复发(P<0.001)和盆腔淋巴结转移(P<0.001)存在显著相关性，且与GINS2低表达患者相比，GINS2高表达的患者的OS更低。结合本研究的结果GINS2的mRNA高表达提示较低的OS(P=0.000 38)，这或许可以假设，由于GINS2的高表达促进了ccRCC的肿瘤细胞增殖并减少凋亡，从而促进了疾病的转移和复发并降低了患者的生存率。总之，本研究提示GINS2基因可以作为ccRCC的预后标志物。

本研究的局限性：仅利用生物信息学技术，通过在线数据库中的数据将GINS家族基因在ccRCC患者中的表达、临床特征信息和预后情况进行分析，接下来希望有更多的临床和基础实验研究来进一步进行验证。