rCIM与mCIM对产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌的检测性能比较

曹 玮，孙 广，李小多

(安顺市人民医院检验科，贵州 安顺 561000)

近几年来，国内耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(carbapenem-resistantEnterobacteriaceae，CRE)的分离率呈现逐年升高趋势。CRE是院内感染的主要病原菌，感染后的死亡率可高达50%[1]。CRE主要包括大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，它们耐药的机制主要是能产生水解碳青霉烯类抗菌药的碳青霉烯酶，即产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌(carbapenemase-producingEnterobacteriaceae，CPE)[2-3]。对CPE进行早期有效地检出，在疾病的预防及控制方面具有重要意义。2018版CLSI将改良碳青霉烯灭活试验(modified carbapenem inactivation method，mCIM)纳入作为微生物药敏试验的执行标准，但是需要的温育时间较长，对早期检测不利[3-5]。基于此，本研究探讨快速碳青霉烯灭活试验(rapid carbapenem inactivation method，rCIM)对CPE的检测性能，以期为临床提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

收集2018年1月至2020年8月安顺市人民医院临床分离得到的90株CRE。采用梅里埃VITEK 2 Compact全自动分析系统进行菌株的鉴定及药敏试验。质控菌株大肠埃希菌ATCC25922，肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705、ATCC BAA1706均购自国家卫生健康委临床检验中心。

1.2 仪器及试剂

梅里埃VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统(法国Bio-Merieux公司)；PCR基因扩增仪(上海启步生物科技有限公司)；电泳仪及凝胶成像系统(成都壹科医疗器械有限公司)；哥伦比亚血平板(广东环凯微生物科技有限公司)；M-H药敏试验琼脂平板(广东环凯微生物科技有限公司)；药敏纸片(杭州微生物试剂有限公司)；胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基(广东环凯微生物科技有限公司)；亚胺培南西司他丁钠(杭州默沙东制药有限公司)；细菌DNA抽提试剂盒(广东环凯微生物科技有限公司)；美罗培南药敏纸片(北京中诺泰安科技有限公司)；PCR试剂盒(广东环凯微生物科技有限公司)；琼脂糖(广东环凯微生物科技有限公司)；DNALadder(广东环凯微生物科技有限公司)；引物合成和PCR产物测序(广东环凯微生物科技有限公司)。

1.3 rCIM检测方法

取培养过夜的菌株20 μL，加入到1 mL的无菌水中进行涡旋混匀，然后加入2片(20 μg)美罗培南纸片至菌悬液中，涡旋混匀，在35 ℃条件下进行0.5 h的温育。离心(10 000 r·min-1，5 min)后取上清液500 μL，加入到2.5 mL ATCC25922(3×108CFU·mL-1)的TSB培养基菌悬液中，在35 ℃条件下进行2 h的孵育，每0.5 h浊度计数1次(记录结果为减去基线后的浊度增长)。肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705为阳性质控菌株，ATCC BAA1706为阴性质控菌株。

1.4 mCIM检测方法

取培养过夜的菌株1 μL，加入到2 mL的TSB培养基中进行涡旋混匀，然后加入1片(10 μg)美罗培南纸片至菌悬液中，涡旋混匀，在35 ℃条件下进行4 h的温育。制备ATCC25922菌悬液(1.5×108CFU·mL-1)，在M-H药敏试验琼脂平板上均匀涂布，干燥10 min。用10 μL接种环取出纸片，挤去多余液体，贴于M-H药敏试验琼脂平板，在35 ℃条件下温育24 h，然后测量抑菌圈直径。抑菌圈直径为6～15 mm或直径为16～18 mm，但抑菌圈内有针尖样散在菌落，则结果判定为阳性，即CPE；抑菌圈直径为16～18 mm或直径≥19 mm，但抑菌圈内有针尖样散在菌落，则结果判定为中介；抑菌圈直径≥19 mm，则结果判定为阴性，即非产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌(non-carbapenemase-producingEnterobacteriaceae，NPE)。

1.5 PCR基因检测方法

按照细菌DNA抽提试剂盒说明书操作要求提取细菌的DNA，对碳青霉烯酶基因blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaOXA-48、blaVIM进行检测，引物序列见表1。反应条件：预变性，94 ℃×5 min；循环，94 ℃×45 s，55 ℃×45 s，72 ℃×1 min，共进行36个循环；延伸，72 ℃×10 min。PCR产物采用电泳仪及凝胶成像系统分析，电压100 V，1 h。PCR扩增阳性结果测序后，用NCBI网站中的Blast程序进行比对。

表1 PCR扩增检测碳青霉烯酶基因的引物序列表

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 rCIM与mCIM筛选CPE的结果分析

90株CRE中，经PCR基因检测显示。CPE 52株，NPE 38株。52株CPE中，肺炎克雷伯菌37株(71.15%)，大肠埃希菌7株(13.46%)，阴沟肠杆菌4株(7.69%)，奇异变形菌与产气肠杆菌各2株(3.85%)；52株CPE中，30株(57.69%)携带blaKPC基因，15株(28.85%)携带blaNDM基因，3株(5.77%)携带blaNDM+blaIMP基因，2株(3.85%)携带blaKPC+blaNDM基因，2株(3.85%)携带blaKPC+blaIMP基因。

52株CPE中，rCIM筛选结果为阳性菌株50株(96.15%)，阴性菌株2株(3.85%)，阴性菌株为奇异变形菌(携带blaNDM基因)；mCIM筛选结果为阳性菌株39株(75.00%)，阴性菌株13株(25.00%)，阴性菌株为7株大肠埃希菌(2株携带blaKPC基因、2株携带blaNDM基因、3株携带blaNDM+blaIMP基因)、2株阴沟肠杆菌(携带blaNDM基因)、2株奇异变形菌(携带blaNDM基因)、2株产气肠杆菌(携带blaNDM基因)。

2.2 rCIM与mCIM检测CPE的价值比较

以PCR基因检测结果为金标准，rCIM检测CPE的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、Kappa值均高于mCIM(均P<0.05)。见表2。

表2 rCIM与mCIM检测CPE的价值比较 n=52

2.3 rCIM与mCIM检测时间及成本的比较

rCIM的初次温育时间、二次温育时间均明显短于mCIM(P<0.05)，每株检测成本明显低于mCIM(P<0.05)。见表3。

表3 rCIM与mCIM检测时间及成本的比较

3 讨论

CPE的不断增多已经成为国内外医院抗感染治疗的主要问题。碳青霉烯酶的基因编码存在于细菌的多个基因元件上，若是细菌的细胞膜受损时，细胞膜的通透性会增加，碳青霉烯酶能够在细菌之间进行传递，从而导致耐药细菌的大量产生并广泛传播[6]。因此，快速有效地检出CPE是临床需要解决的实际问题。与PCR等基因检测方法相比，表型的检测显得更加便捷及经济。目前，常见的碳青霉烯酶表型筛选方法主要包括CIM、改良Hodge试验、Carba NP试验等，但是灵敏度较底，且成本较高[7]。mCIM用于碳青霉烯酶表型筛选的灵敏度及特异度均比较高，是2018版CLSI纳入的微生物药敏试验执行标准。因此，本研究比较rCIM与mCIM对CPE的检测性能，结果显示，在52株CPE中，rCIM检出50株(96.15%)，mCIM检出39株(75.00%)，rCIM检测CPE的敏感度、特异度、一致性Kappa值分别为96.15%、94.76%、0.920，明显高于mCIM的检测效能，但是略低于文献[8]的报道，分析可能与本研究菌株的样本量不够大有一定关系。

本研究90株CRE中，PCR基因检测检出52株CPE(57.77%)，其中30株携带blaKPC基因，15株携带blaNDM基因，说明碳青霉烯酶的产生是本院CRE的主要耐药机制，而以KPC、NDM类型的碳青霉烯酶为主[9]。52株CPE中肺炎克雷伯菌37株(71.15%)，大肠埃希菌7株(13.46%)，阴沟肠杆菌4株(7.69%)；37株肺炎克雷伯菌中，28株携带blaKPC基因，7株携带blaNDM基因，2株携带blaKPC+blaIMP基因，说明本院肺炎克雷伯菌的耐药机制以产KPC类型的碳青霉烯酶为主，与文献[10]报道的一致。本研究未检出携带blaOXA-48、blaVIM基因的CPE菌株，这与国内的流行病学现状[11]相符。虽然说，PCR、质谱等分子生物学方法是检测碳青霉烯酶的金标准，但是操作比较复杂，成本比较昂贵，且可能会遗漏不常见基因类型的碳青霉烯酶[12-13]。而rCIM能够对所有基因类型的碳青霉烯酶进行表型筛选[14]，与mCIM比较，rCIM的检出时间、成本费用均明显降低，且不需要特殊的试剂以及设备。

综上所述，rCIM作为一种快速且经济的检测方法，其对CPE的检测性能优于mCIM。但是也存在一定的不足，需要纳入更大样本、更加多样化的菌株进行研究，以进一步评估rCIM的临床价值。