基于Discovery Studio软件的专业学位CADD研究生课程教学案例设计——抗新冠肺炎中药有效成分山奈酚与靶蛋白的分子对接

张永红，蒋启华，李 艳

（1.重庆医科大学药学院，重庆 400016：2.重庆医科大学中医药学院，重庆 400016）

中药有效成分及天然药物分子的化学结构与药效或生理活性之间的关系，是天然药物研究的主要内容之一。分子层面上，化学结构决定性质；无论是天然药物小分子或是中药有效成分小分子，它们的分子大小、外形、化学反应性、官能团分布和立体构型等都需要与与机体细胞上的靶受体相结合而发挥药效。酶作为一种维持生命活动的重要催化剂，其功能和许多疾病的发生发展相关，因此也通常是非常重要的药物研发的有效作用靶点。新冠疫情出现后，大量相关蛋白酶抑制剂药物研究提上日程，如，与病毒复制转染相关的3CL水解酶（3CLpro）、木瓜样蛋白酶（PLpro）、以及和触突蛋白结合的血管紧张素转化酶（ACE2）等。一直以来，分子对接方法对药物小分子和靶蛋白的作用机制进行研究是计算机辅助药物设计（Computer Aided Drug Design，CADD）课程教学的重点内容之一［1］。深入探讨药物作用机制，有助研究生学习掌握药物分子结构特征，理解受体配体互作关系，提升学习兴趣。传统教学手段难以形象展示药物和靶蛋白的详细结构和具体作用机制，而以往的开源软件DOCK和AUTODOCK等操作复杂，需要学生掌握大量计算机基础知识，都不利于学生认识和掌握相关知识。

随着计算机计算功能增强，计算软件普及，计算机辅助药物分析已经成为药学研究的重要手段之一。计算机辅助药物分析中，分子对接最常用于研究小分子与大分子相互作用模式，尤其是天然药物分子与受体蛋白的作用，分子对接能很好地直观展现，作为CADD课程中主要内容之一，分子对接知识点的学习是一个重点。结合科研工作实践，本文探索基于Discovery Studio（简称DS）分子模拟软件平台可视化、高质量的三维结构展示功能和分子对接模块，设计了中药小分子山奈酚与3CL水解酶的分子对接实验，让学生通过分子对接模拟过程，认识天然药物分子结构特征，理解构效关系特征，获知酶抑制剂和靶蛋白的作用机制，了解和熟练掌握CADD应用于中药材和天然药物研发与药效分析的应用方法。

1 课程实验选题的依据和思考

分子对接技术是专业学位研究生CADD课程教学的主要教学知识点之一。2020级CADD教学开始以抗新型冠状病毒药物研发周期来展开CADD教学示例，因此，对于与病毒复制转染相关的3CL水解酶（3CLpro）、木瓜样蛋白酶（PLpro）、以及和触突蛋白结合的血管紧张素转化酶（ACE2）作为抗冠状病毒药物研发的三个重要靶点［2-3］，3CLpro 和 PLpro是两种在复制和包装新一代病毒过程中起作用的蛋白酶，而细胞表面的ACE2受体让棘突S蛋白有机会与其结合，从而入侵细胞，这三个靶蛋白酶的活性受到抑制都可能导致病毒在体内的复制转染受阻，从而起到预防和治疗新冠的效果，因此三者目前是常用的抗新冠药物研发重点考虑的作用靶点。

另一方面，山奈酚，又名百蕊草素Ⅲ，属于黄酮类化合物，作为目前文献报道的网络药理分析出来多种中药复方中常见的有效成分小分子，在20多种复方中，都作为有效成分出现，文献报道显示山奈酚既能作为ACE2抑制剂也能作为3CLpro抑制剂，与ACE2和3CLpro都有明确的相互作用［4-5］。且二者结构都已经得到解析，在PDB库中都能找到合适的高清晶体结构。针对上述问题，从而考虑利用DS分子模拟软件的分子对接功能，设计山奈酚与3CLpro分子对接的研究生CADD课程实验。

分子对接实验可用于辅助CADD教学，能形象展示构效关系，可作为教学演示，提升教学效果；也可作为药物设计相关课程上机实验或DS软件基本教学操作。通过让学生参与本实验，首先能了解山奈酚分子结构特征，熟悉DS软件分子对接的操作步骤，能利用分子对接方法掌握山奈酚与3CLpro之间相互作用关系，同时，熟悉3CLpro抑制剂的构效关系，进而加深基于靶蛋白的药物设计理念，学好CADD一课。

2 实验内容设计及实验操作步骤

DS是BIOVIA公司集成的一款可视化程度高的面向生命科学研究领域的商业软件，重庆医科大学药学院已购买部分版权，其中包括配体与受体相互作用模块。该模块集成了快速筛选对接模块如LibDock和GOLD，以及对接优化模块CDOCKER和In Situ Ligand Minimization等不同类型分子对接的小模块。其中CDOCKER模块适合于小分子与靶蛋白酶的精确对接，该模块采用高温动力学方法随机搜索配体分子构象，再模拟退火将这些构象在受体活性位点区域进行优化并打分排序，在此基础上获得相对结合稳定的对接结果。目前，DS可适应于Windows/Unix等操作系统，同时拥有可视化友好操作界面，便于演示和让学生操作。因此，CADD课程选用DS中CDOCKER模块利用分子对接方法模拟中药小分子山奈酚（kaempferol）与3CL水解酶（3CLpro）的相互作用。具体实验步骤及实验内容如下。

2.1 靶蛋白结构的载入和受体配体文件预处理

靶蛋白结构如果在PDB数据库中已经存在所需的受体配体复合物晶体结构，结构可直接下载后，通过补充氨基酸残基、蛋白加氢等预处理后，用于分子对接中作为受体使用。由上海科技大学饶子和/杨海涛课题组测定的2019-nCoV冠状病毒3CL水解酶（Mpro）的高分率晶体结构于2020年1月26日被首次报道，晶体结构的坐标可到PDB蛋白质结构数据库（Protein Data Bank，PDB）下载（PDB ID：6LU7）。该团队通过计算机辅助药物设计鉴定了基于机理的抑制剂N3，随后确定了与该化合物复合的COVID-19病毒Mpro的晶体结构。受体/配体复合物的晶体结构（PDB ID：6LU7）诠释了抑制剂和受体之间的作用位点和作用方式。

蛋白文件具体DS平台操作流程如下：第一步，蛋白复合物结构载入的步骤为：File→Open URL→ID：6LU7（输入蛋白PDBID号）。第二步，蛋白文件预处理：在左侧窗口中删除water和ligand groups中除N3的其他配体（仅保留配体N3），依次点击Tools→Macromolecules→prepare protein→clean protein（补充非完整的氨基酸残基，为蛋白加氢等。结果如图1所示蛋白文件处理。第三步，受体Binding Site结合位点定义：由于PDB结构为配体/受体复合物，可以按以下步骤定义活性位点：Tools→Receptor-Ligand Interactions→Define and Edit Binding Site→选中配体N3→From Current selection；然后删除N3，完成活性位点的定义。这种定义结合位点的方法是从现有配体的位置来定义，蛋白上此部位对结合的贡献可能相对比较大，也可以自定义坐标来进行结合位点设定，只是贡献可能性与已有配体出发的位点贡献会存在差别。

Figure 1 Receptor-ligand complex（6LU7） structure（a.complex downloaded from PDB；b.complex deal with dehydration and adding hydrogen）图1 6LU7受体配体复合物结构载入与预处理图（a.PDB库下载得结构；b.去水加氢处理后）

配体小分子结构可以直接在DS平台新的小分子窗口构建或通过其他软件绘制等方式获得。预处理流程为：将画好的小分子三维结构导入，如山奈酚：kaempferol，再依次点击：Tools→Receptor-Ligand Interactions→Dock ligands→Prepare ligands。即处理好了小分子，并能得到不同空间可能的柔性小分子文件。

2.2 基于CDOCKER模块的分子对接模拟

依次点击：Tools→Receptor-Ligand Interactions→Dock ligands→Dock optimization→Dock ligands（CDOCKER）。在弹出的选择窗口中，Input Receptor选择处理好并定义好结合位点的6LU7，Input ligands选项选择Molecules：ALL（预处理完成的配体的文件名，如山奈酚：kaempferol）；因为结合位点已经选择好，结合中参数可以都选定为默认值也可以根据自己实验需要进行参数设定，比如最优结果显示默认10，最后就会显示出10个结合最优的模式；然后点击Run。待程序运行完后，即可获得相关结果。

2.3 分子对接结果可靠性分析

将对接获得的分子构象和从6LU7中提出的N3分子构象放入同一分子窗口。将晶体中的N3构象设置为参考结构，进行RMSD分析。先选中晶体的N3分子，点structrue/RMSD/set reference，再选全部分子，点structure/RMSD/Heavy atoms，得出分子对接结果与原配体分子的RMSD值。分子对接打分最高的分子构象的RMSD值为所有构象中最小值，说明对接结果有良好可靠性。

2.4 分子对接结果分析

对于分子对接结果，通常综合考虑RMSD分析结果和对接打分值，可以选择-CDOCKER_ENERGY得分值最高的构象为最佳结合构象，进行分析，有时候综合考虑-CDOCKER_INTERACTION_ENERGY得分值，两个值都需要高分评为较好构象进行分析。

选择-CDOCKER_ENERGY得分值最高的构象，从Tools窗口，依次打开Tools→Receptor-Ligand Interactions→View Interaction Ligands可以观察受体配体之间的相互作用，同时可考察受体的疏水、溶剂可及、电荷、氢键或离子化表面等状态。6LU7与kaempferol对接结果如图2所示。

Figure 2 Results analyses of 6LU7-kaempferol complex （a.6LU7-kaempferol complex；b.6LU7-kaempferol interaction；c.Hydrophobic surface interaction；d.2D diagram）图2 6LU7与kaempferol对接结果分析图（a.6LU7-kaempferol结合图；b.6 LU7kaempferol相互作用展示图；c.hydrophobic表面展示图 d.二维结果分析图）

从图2可以清晰地看到山奈酚和6LU7的相互作用情况。首先从图2可对非键相互作用直观显示与分析，在视图窗口中如图2b，c，d，受体蛋白氨基酸残基与配体对接poses间的非键相互作用会通过不同颜色的虚线显示出来，且只有参与了同配体之间的相互作用的残基才会显示。另一方面，在DS平台中，展开Receptor-Ligand Interactions/View Interactions，点击Show 2D Diagram。可以看到在一新窗口中打开配体-蛋白相互作用二维平面图，生成山奈酚和6LU7相互作用二维平面图如图2d，便于我们更直观的观察两者的相互作用及关键的氨基酸和基团。

对于3CL水解酶6LU7，对接结果从图中可以看出，CYS145 会与kaempferol苯环上的离域π键产生疏水作用，其中CYS145中巯基上的S原子会与kaempferol苯环的离域π键产生疏水作用（Pi-Sulfur），而CYS145中的烷基会与含氧环上的π键产生作用（Pi-Alkyl），同时，CYS145中HN会与氧形成分子间氢键（Hydrogen bond）。同时，GLY143和SER144都是氨基酸残基上的HN与kaempferol形成氢键，而PHE140和THR26是氨基酸残基上的O与kaempferol形成氢键（Hydrogen bond）。这些作用位点是分子构效关系研究和分子结构改造过程中需要考虑的因素。

另外，受体的表面展示图，考虑到疏水作用在二者间相互作用里占一定比例，我们选用疏水表面如图2c所示。山奈酚分子中酚羟基与邻近环上C=O中氧原子形成分子内氢键，导致分子刚性平面增强，局部极性降低，当与结合时主要在受体的非极性表面（颜色偏浅色而不是蓝色区域）进行结合。在新药分子设计过程中可以结合空腔的分子亲疏水表面情况在该部位优化分子片段，以设计新型药物分子。

3 讨 论

通过采用天然药物分子山奈酚与新冠病毒复制转染相关的3CL水解酶进行分子对接实验内容设计及具体实验操作步骤讲解，从6LU7与kaempferol分子对接流程和对接结果进行详细分析，可以让研究生CADD课程的教授与学习从以下几方面得到启发。

6LU7-N3复合物的高分辨率晶体结构已经获得，便于对接结果与晶体复合物进行比对，以检验分子对接的可靠性。对接模拟结果很好地展示天然药物小分子kaempferol与3CL水解酶6LU7之间的作用模式。对接结果和复合物晶体结构一致性分析，可用来分析天然药物小分子的分子构效关系，可用于CADD课程的辅助教学，解释基于受体的药物设计。

6LU7-kaempferol分子对接涉及到6LU7蛋白结构的预处理，kaempferol分子结构的构建和预处理、CDOCKER对接和对接结果具体分析，能完整展现分子对接全模拟过程。方便研究生自行于DS平台进行分子对接学习和具体上机操作，可作为CADD课程中分子对接知识点的一个完整教学案例。

随着互联网+和计算机硬件技术的飞速发展，CADD相关计算软件，如Molsoft，Gauss，Sybyl和DS等，可视化程度越来越直观、操作越来越大众、简便的应用在药物分子性质研究和新药设计中［6］。将DS软件引入研究生CADD课程教学中，可以形象展示受体蛋白的空间结构、受体配体作用方式、受体配体表面等特征，有利于提升教学效果；同时让专业学位研究生获得一种直观快速了解天然药物小分子与靶蛋白相互作用的工具，为其课题研究提供一定的辅助分析方法支撑。

将获得的分子对接模拟结果和晶体复合物结构进行比对，如果分子对接结果与复合物结构高度一致，则此天然药物小分子抑制剂作为药物研发对象有一定可行性，否则，抑制剂可能不一定可靠。分子对接中Kaempferol与受体氨基酸残基的形成较强的分子间氢键，且部分区域明显存在疏水作用，这些作用位点可能是山奈酚产生生理作用的关键位点。这些位点理论上来说也是3CL水解酶抑制剂开发中对于构效关系，应重点考虑的分子结构因素。这种分析思路的训练，利于培养专业学位研究生对天然药物结构改造的科研思维，使其能对药物设计理念进一步深入。

基于DS模拟平台为药学专业学位研究生CADD课程教学引入了天然药物小分子与2019-nCoV冠状病毒3CL水解酶的分子对接教学演示和操作练习实验。本案例包含了靶蛋白结构的预处理、药物分子结构的构建、分子对接和结果分析等实验内容。通过分子对接案例演示，让研究生学习和演练完整的分子对接模拟过程，掌握天然药物小分子结构特征，理解构效关系特性，学会分析靶酶抑制剂和靶蛋白酶的作用机制，掌握天然药物分子层面的CADD研究方法，为自己的科学研究问题提供一种新思路。本案例已作为研究生课程教学，教学效果将进一步总结和分析。