固本防哮饮含药血清对IL-4刺激的人支气管上皮细胞中IL-27及其信号通路JAK2/STAT1的影响

马凤娟，袁雪晶，牛肖飞

(南京中医药大学附属医院，南京中医药大学儿科研究所，江苏 南京 210029)

支气管哮喘是一种以气道慢性炎症为特征的异质性疾病，其发病率和病死率在全世界范围内呈上升的趋势，据全球哮喘防治创议(GINA)预计，2025年全球哮喘患者将增加至4亿[1]。目前缓解期的治疗主要以吸入性糖皮质激素、长效β2受体激动剂及白三烯受体拮抗剂为主。国外临床研究表明，长期使用糖皮质激素，与使用安慰剂相比，其远期疗效并不高，且具有一定的副作用[2]。固本防哮饮是江苏省中医院著名儿科专家江育仁教授治疗儿童哮喘缓解期的经验方，由玉屏风散和二陈汤加减化裁而来，具有补肺固表、健脾化痰的功效。临床研究发现该方在治疗儿童缓解期哮喘方面有显著效果。本实验主要通过体外实验选择IL-27及其介导的JAK2/STAT1信号通路作为指标来进一步探讨固本防哮饮防治哮喘的内在机制。

1 材料与方法

1.1 动物

选取SPF级SD雌性大鼠15只，体质量250 g左右，购于南京市江宁区青龙山动物养殖场，许可证号：SCKK(浙)2019-0002。饲养条件：分笼饲养于南京中医药大学实验动物中心SPF级动物房，温度控制在22～26 ℃，相对湿度控制在40%～70%，光照12 h,自由饮水、采食。本实验经南京中医药大学动物伦理委员会批准，伦理号为202005A041。将大鼠随机分为空白组、孟鲁司特组和固本防哮饮组，每组各5只。

1.2 细胞

人支气管上皮细胞(16HBE)由南京中医药大学儿科研究所馈赠，培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，置于37 ℃、5%CO2的培养箱中。

1.3 药物

固本防哮饮组方：炙黄芪15 g，党参10 g，白术10 g，茯苓10 g，煅牡蛎15 g，蝉蜕10 g，陈皮6 g，防风6 g，辛夷6 g，五味子6 g和生甘草3 g。饮片均购于江苏省中医院，经江苏省中医院张芹副主任中药师鉴定，符合《中华人民共和国药典》的规定。取8倍量冷水浸药30 min，煎煮30 min(沸后)，滤过；再加6倍量水煎煮30 min，将2次煎液过滤，中药旋蒸仪上旋蒸浓缩成含生药量2 g/mL的溶液，密封于无菌量瓶，4 ℃储存备用。孟鲁斯特钠片(杭州默沙东制药有限公司)。

1.4 试剂

重组IL-4细胞因子(Proteintech公司，批号：200-04-20)；胎牛血清(上海源培生物科技股份有限公司，批号：04-001-1ACS)、RPMI 1640(上海源培生物科技股份有限公司，批号：L210KJ)；0.25%胰酶(批号：S310JV)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(美国Thero pierce，批号：23227)；RIPA裂解液、PMSF(上海碧云天生物技术公司，批号：BL504A、BL507A)；ECL发光液(上海翊圣生物科技公司，批号：36208E60)；兔抗STAT1、JAK2多克隆抗体(美国Immunoway公司，批号：YT6124、YT2426)；总RNA提取试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司,批号：RC101-01)；IL-27 RNA引物、STAT1、JAK2 RNA引物、GAPDH引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]；人IL-27 ELISA试剂盒(上海西塘生物科技公司)。

1.5 仪器

CO2培养箱(日本SANYO公司)；Chemi-Doc化学发光成像仪(美国Bio-Rad公司)；Western Blot电泳仪(美国Bio-Rad公司)；蛋白核酸分析仪、PCR逆转录仪(德国 Eppendorf公司)；荧光定量PCR 仪(型号:Quantstudio 7Flex，美国Life technologies)；多功能酶标仪(Infinite M200PRO，瑞士TECAN公司)。

2 方法

2.1 含药血清的制备

大鼠适应性饲养7 d后，参照实验动物和人体临床用药剂量换算公式(公式1)进行计算[3]。然后按照20 g/(kg·d)的固本防哮饮生药量及孟鲁司特1 mg/(kg·d)灌胃，空白组给予等量的生理盐水灌胃，2次/d，连续给药3 d，末次给药1 h后，局部麻醉，无菌条件下腹主动脉取血，静置1 h后无菌离心取血清，56 ℃水浴锅灭活30 min后分装，-20 ℃保存备用。

(1)

2.2 CCK8法测定含药血清的最大无毒浓度

细胞计数后按每孔8 000个细胞接种于两块96孔板中，除去四周加PBS孔，每块从左到右依次加入100 μL浓度为5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%的含药血清，另设一组空白组和一组单培组，每组设3个复孔，培养12、24 h后分别取出一块96孔板，加入CCK8试剂继续培养2 h后用酶标仪测定波长在450 nm处的OD值。本实验选取细胞加入含药血清培养24 h后加入CCK8试剂继续培养2 h后的OD值，以细胞存活率90%以上计算最大无毒浓度(公式2)。

细胞活力(%)=(A实验-A空白)/(A正常-A空白)×100%

(2)

2.3 细胞模型的建立、实验分组及给药

选取人支气管上皮细胞(16HBE)，培养于T25瓶，至于环境条件为37 ℃、5% CO2的培养箱中，待细胞铺满单层后予以胰酶消化后传代，并以5×105/mL的浓度接种于6孔板中，贴壁生长约70%～80%，模型组及给药组予以IL-4细胞因子以100 ng/mL浓度干预24 h造模[4]。

实验分组：正常组、模型组、孟鲁司特组和固本防哮饮低剂量组、中剂量组、高剂量组(药物干预均在模型基础上干预)。

药物干预剂量：正常组(10%空白含药血清),模型组(10%空白含药血清),孟鲁司特组(10%孟鲁司特含药血清),固本防哮饮低剂量组(5%固本防哮饮含药血清)，中剂量组(10%固本防哮饮含药血清)、高剂量组(15%固本防哮饮含药血清)，干预时间均为24 h。

2.4 观察指标及方法

2.4.1 ELISA法检测细胞上清液中IL-27的表达水平

本实验采用上海西塘生物科技公司的人IL-27 ELISA检测试剂盒，具体操作步骤详见说明书。

2.4.2 蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞中JAK2、STAT1蛋白的表达水平

收集细胞，浓度为2×106～5×106/mL,加入RIPA裂解液50 μL,离心后取上清，采用BCA法测定蛋白浓度(按Thermo试剂盒说明书操作)，将蛋白浓度设定为2 μg/μL，按照原液体积+水的体积：5×上样缓冲液=4∶1的比例进行稀释后煮沸变性。配8%的分离胶，5%的积层胶，取蛋白上样量为30 μg,设定S1(积层胶)电压为80 V，30 min；S2(分离胶)电压110 V，进行恒压垂直电泳1 h。电泳结束后采用湿转法进行转膜，恒流300 mA，100 min。转膜结束后予以1×TBST洗膜3次，每次10 min，后予以5%的BSA封闭1 h，封闭结束后继续予以1×TBST洗膜3次，每次10 min，洗膜结束后分别加入1∶1 000、1∶1 000、1∶5 000稀释度的兔抗鼠JAK2、STAT1、TUBLIN一抗孵育，4 ℃过夜。一抗孵育结束后予以1×TBST洗膜3次，每次10 min，后在室温下孵育稀释度为1∶5 000的二抗1 h，孵育完毕后再次予以1×TBST洗膜3次，每次10 min，后予以均匀添加ECL发光液，上机曝光。使用Image J 软件量化条带的灰度值，把目的条带的灰度值与内参的灰度值的比值作为目的基因蛋白的相对表达量。

2.4.3 实时定量PCR(Real-time RT-qPCR)检测细胞中IL-27、JAK2、STAT1的mRNA表达水平

按照诺唯赞总RNA试剂盒步骤提取RNA，紫外分光光度计测其浓度。按照诺唯赞逆转录试剂盒说明将RNA逆转录成cDNA。设计上述指标的引物，以GAPDH为内参对照(引物序列详见表1)。按照20 μL体系(SYBR 10 μL、前引、后引各0.4 μL、DEPC水7.2 μL、cDNA 2 μL)加入96孔板内。三步法进行Real-time RT-qPCR检测，第一步95 ℃ 30 s；第二步95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s；第三步 95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，进行40个循环。结果以内参GAPDH进行校准，以2-△△CT公式计算。

表1 Real-time PCR引物序列

2.5 统计学分析

采用Graphpad prism 8.0数据分析软件进行数据分析，采用单因素方差分析(one-way ANVOA)比较各组间差异的显著性，以P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 不同稀释度的固本防哮饮含药血清对16HBE细胞存活率的影响

在16HBE细胞中，不同稀释度固本防哮饮含药血清对细胞存活率的影响见表2。本实验采取细胞存活率>90%的浓度为最大无毒浓度，故选用15%的固本防哮饮含药血清浓度度为最大无毒浓度，以5%为固本防哮饮低剂量组、10%为固本防哮饮中剂量组、15%为固本防哮饮高剂量组。

表2 固本防哮饮含药血清对16HBE细胞的影响

3.2 酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞中IL-27蛋白的表达水平

与空白组相比，模型组细胞中IL-27表达水平显著升高，具有统计学意义(P<0.01)；4个治疗组与模型组相比，细胞中IL-27表达水平均有明显降低，差异具有显著的统计学意义(P<0.01)；但固本防哮饮各剂量组与孟鲁司特组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；固本防哮饮各剂量组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表3。

表3 ELISA法检测各组细胞中IL-27蛋白表达水平

3.3 Western blot法测定细胞中JAK2、STAT1蛋白的表达水平

与空白组相比，模型组中JAK2、STAT1均显著升高；与模型组相比，4个治疗组中JAK2、STAT1蛋白表达水平均降低，差异具有显著的统计学意义(P<0.01)；孟鲁司特组与固本防哮饮各剂量组相比，无统计学意义(P>0.05)；固本防哮饮各剂量组之间相比,无统计学意义(P>0.05)。结果见表4和图1。

表4 Western Blot法检测各组细胞中JAK2、STAT1蛋白表达水平

3.4 Real-time RT-qPCR法检测细胞中IL-27、JAK2、STAT1 mRNA的表达

与空白组对比，模型组中IL-27、JAK2、STAT1 mRNA均升高；与模型组相比，固本防哮饮各剂量组及孟鲁司特组均下调，其差异具有显著的统计学意义(P<0.01)；孟鲁司特组与固本防哮饮各剂量组相比，无统计学意义，且固本防哮饮各剂量组之间比较，无统计学意义(P>0.05)。结果见表5。

4 讨论

支气管哮喘是由多种细胞(如气道上皮细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞等)和细胞因子参与的以气道慢性炎症为特征的异质性疾病。哮喘发病机制有多种假说，其中最经典的是Th1/Th2失衡学说。固有的Th2细胞稳定性是治疗过敏性疾病的重要障碍，因此免疫治疗方面的研究都是旨在抑制Th2反应，诱导Th1反应，从而调节Th1/Th2平衡。

注：A.空白组；B.模型组；C.孟鲁司特钠组；D.固本防哮饮低剂量组；E.固本防哮饮中剂量组；F.固本防哮饮高剂量组。图1 各组细胞中JAK2、STAT1蛋白免疫印迹图

表5 各组细胞中IL-27、JAK2、STAT1基因表达水平

IL-4主要由Th2细胞分泌，并通过释放IgE和促炎因子在哮喘的气道炎症和气道高反应性中发挥重要作用[4]。人支气管上皮细胞是炎症反应的主要靶细胞，在哮喘炎症修复过程中起关键作用[5]。IL-27是IL-12家族的新成员, 它是由两个亚基P28和EBI3组成的异二聚体分子,主要由活化的抗原呈递细胞(尤其是树突状细胞和肺巨噬细胞)产生[6]。IL-27可以协同促进初始CD4+T细胞产生IFN-γ，并促进Th0细胞分化为Th1细胞，并具有抑制Th2细胞功能的作用[7]。研究发现[8],与野生型小鼠相比，EBI3缺陷的小鼠表现为更严重的气道高反应性。在健康的人类外周血中，IL-27 可以让CD4+T细胞增殖，并加速向Th1细胞分化，从而起到防范哮喘的作用；但对于哮喘患者这种反应却不明显，这可能与IL-27能抑制初始的CD4+T细胞的Th2分化，但无法抑制已分化的Th2细胞的再分化有关[9]。Chen等[10]研究发现血清IL-4水平高的哮喘患者，Th2细胞分化受IL-27抑制并不明显，重复或高剂量IL-4刺激可诱导Th2细胞抵抗IL-27介导的抑制。苏孝琼等[11]为了探究IL-27处理后小鼠T淋巴细胞的信号传递，采用了IFN-γ(-/-)、T-bet(-/-)、STAT1(-/-)基因敲除小鼠，发现仅STAT1敲除可抵消IL-27的效应，证实IL-27是借助STAT1信号通路活化而传递信号的。JAK/STAT信号传导通路通过激活STAT1参与IL-4等细胞因子的信号传导过程，从而诱导下游靶基因的表达，进而引起哮喘患者气道高反应和慢性气道炎症反应[12]。

固本防哮饮是江苏省中医院江育仁教授基于“扶正固本”的指导思想下形成的治疗哮喘的经验方，“预防”为治疗的着重点，由炙黄芪、党参、白术、茯苓、煅牡蛎、蝉蜕、陈皮、防风、辛夷、五味子和生甘草组成，具有补肺固表、健脾化痰的功效，疗效确切，临床可增强患儿体质，减少哮喘发作次数，提高患儿的生存质量。课题组前期通过临床随机对照试验观察发现,哮喘缓解期治疗组使用固本防哮饮联合定喘敷贴膏有效率高于布地奈德对照组[13]，且通过动物实验研究发现其可通过上调TLR4、TLR7达到防治哮喘的目的[14]。

本实验在体外通过IL-4细胞因子刺激支气管上皮细胞构建哮喘慢性气道炎症模型，而孟鲁司特钠为儿童哮喘缓解期常用的口服控制性药物，因此选为对照药物。与空白组相比，模型组中IL-27、JAK2、STAT1蛋白和mRNA表达均上调，可见IL-27在本实验中起促炎性因子的作用；且通过诱导JAK2/STAT1信号通路的激活引起气道慢性炎症；固本防哮饮含药血清干预后，与模型组相比，IL-27、JAK2、STAT1蛋白和mRNA表达均下调，表明固本防哮饮可能通过下调IL-27及其JAK2/STAT1信号通路的相关因子起调控作用。