A20、MⅠCA和MⅠCB在脂肪变肝星状细胞中的表达及作用研究

王晓晗 韩 丰 沈 亮 陈云清 沈月玉 高 晨 侯震涛 冀子中 范竹萍

肝星状细胞(HSC)活化被认为是肝纤维发生的关键[1]。HSC的活化过程包括早期的启动激活和后期的持续性激活，短时间的肝损伤可引起HSC的启动激活，而慢性炎性反应是HSC持续激活的基础[2]。有研究发现，肝内脂质沉积引起的氧化应激等脂毒性表现与肝纤维化进展有关[3]。A20作为调控炎性反应的一种重要蛋白，在炎性反应激活后可被诱导表达，其对炎性反应的调控作用已被深入研究[2,4-6]。本研究主要探究A20、主要组织相容性复合物Ⅰ类链相关基因A(MⅠCA)、MⅠCB在脂肪变HSC中的表达及作用。

1 材料与方法

1.1 脂肪变HSC的制备

取油酸(不饱和脂肪酸)和软脂酸(饱和脂肪酸)比例为2∶1的混合脂肪酸(FFA)，配置物质的量浓度为0.5 mmol/L，实验组采用FFA刺激人HSC LX-2细胞(购自ATCC)24 h，以诱导其发生脂肪变，对照组不予FFA刺激，留取细胞备用。

1.2 油红O染色

FFA作用于LX-2细胞24 h后，弃去培养皿中的培养液，用PBS漂洗。加入4%多聚甲醛固定30 min，蒸馏水洗涤。油红O液浸染30 min，显微镜下观察染色情况。蒸馏水洗涤，60%乙醇浸洗细胞5～10 s。蒸馏水洗涤，苏木素染液浸染20 s，水洗，干片，拍照。

1.3 RNA分离及实时荧光定量PCR

取实验组和对照组LX-2细胞，漂洗后加入1 mL TRIzol试剂提取总RNA，逆转录合成cDNA(37 ℃ 15 min，84 ℃ 5 s，4 ℃ 30 min)，实时荧光定量PCR(real-time qPCR)法分析A20、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅲ型胶原、MⅠCA、MⅠCB的mRNA表达。总反应体系共10 μL，步骤为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。逆转录试剂盒、SYBR qPCR试剂盒均购自日本TaKaRa公司。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列见表1。以β-actin作为内参，采用2-△△Ct计算目的基因的相对表达量。所有实验均重复3次。

表1 引物序列

1.4 统计学处理

应用Graph pad Prism 5软件进行统计学分析，各组数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脂肪变LX-2细胞的制备

LX-2细胞呈梭形或多边形，实验组LX-2细胞采用FFA刺激24 h后，油红O染色示细胞质内有明显的红色脂质颗粒沉积，而未予FFA刺激的对照组LX-2细胞内脂质颗粒明显少于实验组细胞。见图1。

图1 两组LX-2细胞 油红O染色 ×100 A 对照组 B 实验组

2.2 两组LX-2细胞中α-SMA、Ⅲ型胶原的mRNA表达水平比较

real-time qPCR法检测结果显示，实验组LX-2细胞中α-SMA、Ⅲ型胶原的mRNA表达水平(1.53±0.18，2.40±0.81)均较对照组明显升高，分别为对照组的1.53倍、2.40倍，差异均有统计学意义(P=0.035，P=0.041)。见图2。

2.3 两组LX-2细胞中A20的mRNA表达水平比较

real-time qPCR法检测结果显示，实验组LX-2细胞中A20 mRNA的表达水平(3.32±0.67)较对照组明显升高，为对照组的3.32倍，差异有统计学意义(P=0.027)。见图3。

注：*P<0.05

注：*P<0.05

2.4 两组LX-2细胞中MⅠCA、MⅠCB的mRNA表达水平比较

real-time qPCR法检测结果显示，实验组LX-2细胞中MⅠCA、MⅠCB的mRNA表达水平(3.09±1.30，16.50±2.47)均较对照组明显升高，分别为对照组的3.09倍、16.50倍，差异均有统计学意义(P=0.049，P=0.008)。见图4。

注：*P<0.05；**P<0.01

3 讨论

肝纤维化的特征是纤维结缔组织的过量形成和沉积，导致进行性组织重塑。目前已知遗传性疾病、慢性病毒感染、乙醇滥用、自身免疫性疾病、代谢紊乱、胆汁淤积、胆汁酸成分或水平的改变、静脉阻塞和寄生虫感染都是导致肝纤维化的因素。此外，过量的脂肪和其他脂肪毒性介质引起的内质网应激、线粒体功能改变、氧化应激及肠道菌群改变均与非酒精性脂肪性肝病相关，可促使肝纤维化的发生、发展[7]。本研究发现，在脂肪变HSC中α-SMA、Ⅲ型胶原的mRNA表达水平升高。过量脂肪酸摄取诱导的氧化应激可引起肝损伤和炎性免疫细胞的持续募集，引起肝纤维化，从而促进单纯性脂肪肝向非酒精性脂肪性肝炎(NASH)进展[8]。

A20作为一种泛素修饰酶，在炎性反应的调控中发挥着重要作用[9-10]。本课题组的前期研究表明，在肝细胞和巨噬细胞中，过表达A20可抑制炎性反应和减轻细胞内脂质沉积；敲除A20后肝细胞和巨噬细胞内炎性反应加重、脂质沉积增加[5-6]。而对于A20在HSC脂质沉积中的作用的研究较少。有研究显示，高脂饮食诱导的小鼠心脏损伤模型中，A20能改善小鼠的脂质累积、氧化应激、炎性反应、细胞凋亡，以及心肌肥厚、纤维化和心功能障碍[11]。另有研究表明，A20在肝脏保护中起关键作用，包括抑制肝损伤后的炎性反应，刺激肝细胞生长，防止肝脏缺血再灌注损伤[12]。在白色脂肪组织中，A20是脂联素抗炎作用的中介物质，是减轻肥胖相关病理的潜在靶点[13]。A20蛋白的高表达可能成为预防NASH进展的潜在治疗策略[6]。脂肪酸、肠源性内毒素等物质可通过与HSC的Toll样受体4(TLR4)结合诱导炎性反应发生，炎性反应发生时，循环中TNF-α、IL-1β等炎性因子和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)等趋化因子水平明显升高，这些细胞因子可通过持续性激活HSC产生细胞外基质，参与肝纤维化的形成。本研究中，FFA引起的脂肪变HSC中A20 mRNA表达升高，具体机制有待进一步探索。

有研究发现MⅠCA和MⅠCB水平在溃疡性结肠炎(UC)患者中升高，推测其可能在炎性反应局部发挥作用[14]。本研究发现MⅠCA、MⅠCBmRNA在脂肪变HSC中表达升高，其在肝纤维化中的作用有待进一步研究阐明。MⅠCA和MⅠCB作为NK细胞2家族成员D(NKG2D)受体的配体，在肝脏炎性反应过程中，在HSC对NK细胞的易感性中起重要作用[15]。在药物性肝损伤研究中，人原代肝细胞中MⅠCA、MⅠCB在多种药物作用下表达升高[16]。在原发性肝癌细胞中，通过上调MⅠCA和MⅠCB表达，从而促进了肝癌细胞被NK细胞识别和清除，其可作为新型免疫治疗药物的研发方向[17]。

综上所述，在脂肪变HSC中，A20、MⅠCA、MⅠCB的表达水平升高，可能在肝纤维化过程中发挥协同作用，具体机制还有待进一步研究阐明。