长链非编码RNA MEG3对老年乙型肝炎并发肝硬化和肝纤维化的诊断价值

赵红英 王文浩 孙宁宁

肝纤维化是由多种病因导致的一种复杂的病理生理过程，是慢性肝病共同的病理特征。目前对于肝纤维化尚无特效治疗方案，常难以治愈，可进一步发展为肝硬化。肝纤维化的病理特征为细胞外基质在窦周间隙沉积，而细胞外基质合成和降解失衡是导致患者出现肝纤维化的主要原因[1]。目前主要采用组织病理学、影像学及分子标志物检查诊断肝纤维化，其中组织病理学为诊断肝纤维化的金标准，但其属于创伤性检查，患者接受度较低；影像学检查虽具有简便、快捷的优势，但临床缺乏特异性，无法进行早期诊断。目前已有一些生物标志物可用于诊断乙型肝炎肝硬化或肝纤维化，如金属基质蛋白酶、Ⅳ型胶原等，但它们的敏感度和特异度较低[2-3]。因此，寻找新的具有高敏感度、高特异度的生物标志物对于早期诊断乙型肝炎肝硬化和纤维化具有重要的临床价值。lncRNA是一种长链非编码RNA，与人类的多种疾病有关，比如lncRNA母源性印记基因3(lncRNA MEG3)可抑制心脏纤维化[4]。研究表明，lncRNA MEG3通过SMO蛋白和miR-212途径抑制肝星状细胞的活化，可作为肝纤维化发生和发展过程中重要的生物标志物[5]。研究发现，在乙型肝炎合并肝纤维化的患者中，血清lncRNA MEG3水平低于健康对照组，其与肝纤维化程度呈负相关[6]。提示lncRNA MEG3是乙型肝炎肝纤维化的重要生物标志物。本研究通过分析乙型肝炎并发肝硬化和肝纤维化患者中lncRNA MEG3的表达水平，以期明确lncRNA MEG3对乙型肝炎并发肝硬化和肝纤维化的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2017年9月至2019年11月在沧州市中心医院就诊的60例老年乙型肝炎并发肝硬化和肝纤维化患者，其中男性35例，女性25例，年龄60～75岁，平均年龄为(66.52±5.41)岁，平均BMI为(21.32±6.46)kg/m2；其中肝硬化患者30例，肝纤维化患者30例，分别设为肝硬化组和肝纤维化组。肝硬化组中男性19例，女性11例，年龄60～75岁，平均年龄为(66.31±5.70)岁，平均BMI为(21.54±6.84)kg/m2；肝纤维化组中男性16例，女性14例，年龄60～75岁，平均年龄为(66.89±5.53)岁，平均BMI为(21.20±6.33)kg/m2。纳入标准：(1)年龄≥60岁；(2)患者均符合《慢性乙型肝炎诊断标准(2015年版)》[7]中乙型肝炎的诊断标准；(3)签署知情同意书；(4)无其他重大疾病，能够配合此次研究。排除标准：(1)近1个月内接受过抗病毒药物的治疗；(2)具有器质性病变者；(3)伴有精神疾病或认知障碍者；(4)合并有器官衰竭、恶性肿瘤者；(5)临床资料缺失者。另选择同期在本院进行手术治疗的30例老年肝血管瘤患者作为对照组，其中男性16例，女性14例，年龄60～75岁，平均年龄为(66.78±5.23)岁，平均BMI为(22.04±5.28)kg/m2。肝硬化组、肝纤维化组和对照组在年龄、性别、BMI方面差异无统计学意义，具有可比性。本研究经沧州市中心医院医学伦理委员会批准(批件号2017018)。

1.2 研究方法

1.2.1 Ishak肝脏病变严重程度评分 肝纤维化和肝硬化患者进行超声引导下经皮穿刺或组织学检查，对照组患者术中获取肝组织，使用4%甲醛固定所取得的肝组织。取部分组织进行石蜡包埋，5 μm厚度切片，然后行H-E染色。采用Ishak评分系统评估肝脏疾病分期，Ishak评分≥3分提示肝纤维化，Ishak评分≥5分提示肝硬化。

1.2.2 lncRNA MEG3表达水平检测 取少量受试者的肝组织，采用实时荧光定量PCR(real-time qPCR)法检测肝组织lncRNA MEG3的表达水平。参照TRIzol试剂盒说明书提取总RNA，应用BIO-RAD反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，然后25 ℃ 5 min、42 ℃ 30 min、85 ℃ 5 min灭活反转录酶活性，使用去离子水将cDNA稀释10倍后置于-20 ℃保存。进行real-time qPCR操作，反应条件为95 ℃预变性1 min，之后94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、74 ℃ 30 s，共40个循环。以β-actin作为内参，采用2-ΔΔCt计算lncRNA MEG3的相对表达量[5]。引物由上海瀚杭生物科技有限公司设计并合成，序列见表1。

表1 引物序列

1.2.3 蛋白质印迹法检测相关蛋白表达 从液氮罐中取出肝组织冻存管，解冻后按照实验室方法培养，加入蛋白裂解液，提取总蛋白。使用BCA蛋白试剂盒测定细胞中总蛋白含量，以GAPDH为内参，采用蛋白质印迹法检测肝组织中β-连环蛋白(β-catenin)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)的表达水平。以GAPDH为内参，应用Tanon 1600全自动数码凝胶图像分析系统拍照并进行半定量分析。实验重复3次，取平均值。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 肝纤维化组和肝硬化组Ishak评分比较

肝纤维化组Ishak评分为(4.02±0.95)分，低于肝硬化组[(7.31±2.20)分]，差异有统计学意义(t=7.520，P<0.001)。

2.2 各组肝组织中lncRNA MEG3表达水平比较

对照组、肝纤维化组、肝硬化组lncRNA MEG3的表达水平中位数分别为17.96(11.84，20.50)、10.38(7.36，12.88)、5.27(4.18，6.68)。与对照组比较，肝纤维化组、肝硬化组lncRNA MEG3表达水平均降低，差异均有统计学意义(P均<0.05)；与肝纤维化组比较，肝硬化组lncRNA MEG3表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注：与对照组比较，*P<0.05；与肝纤维化组比较，#P<0.05

2.3 各组肝组织中β-catenin、Cyclin D1、Cleaved Caspase-3表达水平比较

与对照组比较，肝纤维化组、肝硬化组β-catenin、Cyclin D1、Cleaved Caspase-3表达水平均升高，差异均有统计学意义(P均<0.05)；肝纤维化组与肝硬化组β-catenin、Cyclin D1、Cleaved Caspase-3的表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2、图2。

表2 各组肝组织中β-catenin、Cyclin D1、Cleaved Caspase-3表达水平比较

图2 各组肝组织中β-catenin、Cyclin D1、Cleaved Caspase-3的表达水平

2.4 相关性分析

老年乙型肝炎患者肝组织中lncRNA MEG3表达水平与Ishak评分呈负相关，即lncRNA MEG3表达水平越低，肝脏组织病变可能越严重。见表3。

表3 lncRNA MEG3、β-catenin、Cyclin D1、Cleaved Caspase-3表达与Ishak评分相关性

2.5 lncRNA MEG3对肝纤维化和肝硬化的诊断价值

lncRNA MEG3诊断肝纤维化的ROC曲线下面积(AUC)为0.930，最佳截断值为13.12，敏感度为86.7%，特异度为93.3%(见图3A)。lncRNA MEG3诊断肝硬化的ROC AUC为0.926，最佳截断值为7.32，敏感度为96.3%、特异度为76.8%(见图3B)。

图3 lncRNA MEG3诊断肝纤维化和肝硬化的ROC曲线 A 肝纤维化 B 肝硬化

3 讨论

乙型肝炎是一种危害性较大的传染性疾病，据相关数据统计，全世界约20亿人感染HBV，其中约4亿人属于慢性HBV感染者，约占总数的6%[8]。乙型肝炎患者若不及时进行积极治疗，可逐渐发展为肝硬化，甚至肝细胞癌[9]。机体感染HBV后，病毒在体内不断复制，启动自身免疫应答系统清除病毒时，亦可导致肝细胞损伤，且可能进一步导致肝纤维化。肝活组织检查是诊断肝纤维化的金标准，但此种诊断方式为有创性检查，且价格昂贵，患者不易接受[10]。因此，探寻敏感度和特异度均较高的检查方式具有重要的临床意义。

lncRNA作为非编码RNA的重要组成部分，可参与肿瘤生长、转移及侵袭等多种生物学行为。王冰等[11]研究显示，lncRNA MEG3可通过靶向Rac1信号通路，在宫颈癌细胞增殖、迁移过程中发挥抑制作用。研究表明，有多个lncRNA分子被证实可通过多种方式参与肝硬化的形成过程[12]。lncRNA MEG3首次被发现于小鼠大脑中，其表达水平降低与肝癌细胞的增殖和凋亡有关[13]。Yu等[5]研究报道，慢性乙型肝炎合并肝纤维化患者中lncRNA MEG3的表达水平明显低于健康对照组。本研究检测了乙型肝炎并发肝纤维化和肝硬化患者肝组织中lncRNA MEG3的表达水平，并与对照组进行比较，结果发现对照组lncRNA MEG3的表达水平最高，其次为肝纤维化组，而肝硬化组最低，与Yu等[5]的研究结论相符，提示肝组织中lncRNA MEG3表达水平降低可能与老年乙型肝炎患者并发肝纤维化和肝硬化有一定关联。

Caspase-3与细胞增殖及凋亡具有密切的联系，其属于Caspase家族，是一种效应蛋白，研究显示多种信号通路凋亡期间可能激活Caspase-3，从而促使肝星状细胞增殖与凋亡[14]。本研究发现，乙型肝炎肝硬化和肝纤维患者肝组织中β-catenin、Cyclin D1、Cleaved Caspase-3表达水平均较对照组升高，提示肝组织β-catenin、Cyclin D1、Cleaved Caspase-3表达水平升高参与了老年乙型肝炎患者肝纤维化和肝硬化的发生。Pearson检验分析发现，老年乙型肝炎患者肝组织中lncRNA MEG3表达水平与Ishak评分呈负相关，提示老年乙型肝炎患者lncRNA MEG3表达水平越低，肝脏组织病变可能越严重。β-catenin、Cyclin D1、Cleaved Caspase-3与Ishak评分无明显相关性，此结果需增加样本量进一步分析。此外，ROC曲线分析显示，lncRNA MEG3可作为诊断老年乙型肝炎患者肝纤维化和肝硬化的指标，且诊断肝纤维化的特异度较高，诊断肝硬化的敏感度相对较高，具有一定推广价值。

综上所述，lncRNA MEG3在老年乙型肝炎并发肝硬化和肝纤维化患者中的表达水平较高，可作为此类患者的早期血清生物标志物，在诊断乙型肝炎并发肝硬化和肝纤维等方面具有重要价值，并可用于评估患者的病情严重程度，值得在临床推广应用。