温敏型生物材料羟丁基壳聚糖的辐射裂解研究

林福星 戴婧婷 罗菊香 张建汉

【摘 要】 壳聚糖毒性很低、生物相容性很好，同时又能夠在生物体内降解，而受到学者们的关注。然而壳聚糖的水溶性太差，使得应用研究很难开展。本文研究证实，裂解后HBC的分子量明显降低，而MTT细胞实验证实，裂解后HBC的细胞毒性依然很低，完全可以应用于生物材料领域。本课题为温敏型生物材料HBC在生物、医学等领域的推广应用提供了坚实的基础。

【关键词】 生物材料;壳聚糖;辐射裂解;分子量;细胞毒性

【中图分类号】 Q356.1 【文献标识码】 A 【文章编号】 2096-4102（2021）03-0097-03

壳聚糖是脱乙酰度（脱去乙酰基的葡萄糖胺单元数占总单元数的比例）在55%以上的甲壳质的总称。壳聚糖具备了低细胞毒性、优异的生物相容性、自然生物可降解性等优良性能，在生物材料领域的应用中具备极大的潜力。

在分子结构上，由于壳聚糖链上众多的羟基（-OH）以及氨基（-NH2）等基团很容易形成氢键，因此，壳聚糖的溶解性非常差。容易发生聚沉，稳定的溶液浓度较低。通常，壳聚糖溶液的质量分数只能是1%-3%。

壳聚糖的应用在食品、化妆品等行业很常见，然而，壳聚糖的应用性能始终受限于溶解性，存在明显的瓶颈。为了解决这个难题，本课题组设计改性并报道合成了一种亲水性壳聚糖——羟丁基壳聚糖（HBC）。实验结果证实，HBC在溶解性上有了比较大的提升。

由于生物材料在应用过程中，经常会用到辐射灭菌技术，以保证生物材料的安全性能。因此，对于生物材料HBC而言，他们的抗辐射稳定性需要进行一定的探索，并且研究他们在辐照过程中的变化。

本研究通过之前报道的方法将羟丁基键合到壳聚糖的羟基和氨基上，成功合成了HBC。为了验证HBC的辐射稳定性以及辐射产物的安全性，将HBC溶液放置在60Coγ-ray的辐照下进行一定剂量（分别是0kGy，1kGy，2kGy，3kGy，5kGy，10kGy，）的辐照。之后对辐照制备的样品进行后续的分析，包括分子量的测定和细胞毒性的研究。研究结果证实，经过辐照裂解过程之后，HBC分子量有所降低，且降低的程度与辐照剂量呈现正相关。另外，细胞毒性MTT实验显示，经过辐照裂解后的HBC毒性非常低，哪怕在10ug/mL的浓度下，细胞存活率依然在93.3%。这充分说明了HBC对细胞的生长没有毒性作用，是非常良好的生物材料。这为HBC在生物、医学等领域的推广应用提供了坚实的基础。

1材料与方法

1.1材料

壳聚糖（分子量Mw=2.0×105Da，脱乙酰度≧90%）以及1，2-环氧丁烷购自阿拉丁化学试剂有限公司。聚乙酰亚胺（PEI）来自美国赛默飞世尔科技有限公司。氢氧化钠（片状，97.0%-100%）、异丙醇（99.7%）、丙酮（99.5%）购自医药集团化学试剂有限公司。

细胞毒性实验使用的3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基氮唑溴盐（MTT）由碧云天生物科技有限公司提供，人宫颈癌细胞（Hela）培养在37oC以及含5%CO2的空气中。胎牛血清从浙江天杭生物科技股份有限公司购买，青霉素-链霉素从美国英杰生物试剂有限公司购买，并添加在DMEM全培养基中。

本实验中所使用的水均为去离子水，且上述试剂均为即买即用。

1.2 HBC的制备过程

HBC的制备原理如图1所示。

首先，称取25gNaOH片状固体加入100mL烧杯，倒入50mL水并快速搅拌，待片状固体全部溶解后通氮气15min。随后，取4g壳聚糖粉末加入上述的NaOH溶液中继续搅拌，通氮气15min。过滤，并用水洗至pH=7。之后，将滤纸上的固体加入到异丙醇/水混合溶液（V∶V=9∶1）中，并搅拌反应24h。接着，将1，2-环氧丁烷加入上一步的溶液，并继续通氮气15min，搅拌反应4d。然后，用丙酮沉淀并离心。将离心下来的沉淀物用水超声洗涤，再离心分离，直至pH=9，真空干燥24h。

1.3不同吸收剂量的辐照后羟丁基壳聚糖的制备（HBC-X，X表示辐照过程中的总吸收剂量）

为了研究羟丁基壳聚糖在辐照过程的性能变化，需要将HBC溶液置于辐射源的辐照下。首先，用天平称取10mg的羟丁基壳聚糖粉末溶解在上述的10mL浓度为0.1mol/L乙酸溶液中，超声溶解，并通氮气10min。之后，将羟丁基壳聚糖溶液样品置于60Coγ-ray下辐照，剂量率为8.3Gy/min。控制不同的吸收剂量，得到不同的辐照后羟丁基壳聚糖（HBC-X）。

1.4 HBC-X的分子量测定

为了探究HBC溶液在辐照过程中变化，通过黏度法在25±0.1℃对不同吸收剂量辐照后的HBC样品分子量进行测定。纯溶剂的流出时间以1%的醋酸溶液在乌氏黏度计内的流出时间t0计算。在测试过程中，每个流出时间的测定都需要进行3次取平均值，且3次测量结果之间的极差不超过0.5s。接着，测定吸收不同剂量辐照的HBC样品（HBC-0、HBC-1、HBC-2和HBC-3、HBC-5、HBC-10）的设置浓度梯度溶液（1、2/3、1/2）的流出时间，分别记为t1、t2和t3，然后根据设置浓度梯度的羟丁基壳聚糖溶液的流出时间（t1、t2和t3）和纯溶剂的流出时间（t0），分别计算不同吸收剂量辐照后的HBC溶液的增比黏度?sp和相对黏度?r。最后，通过?sp/c和ln?r/c分别对HBC溶液的浓度c作图，外推可得不同HBC溶液的特性黏度[?]，并通过公式1计算不同吸收剂量辐照后HBC的分子量。

[?]=K·Mα 公式1

公式1中，[?]是测得的特性黏度，K=1.8×10-3cm3·g-1，α=0.93，均为常数。

1.5 HBC-X的细胞毒性研究

为了体现HBC-X的细胞毒性水平，本次实验选用常用的生物材料PEI作为对照，通过MTT细胞毒性实验来表征测定。首先，以每孔5000个的密度在96孔细胞培养板上进行Hela细胞的培养，每孔添加200?L的含10%FBS、1%青霉素-链霉素的培养基，37oC下生长15h。之后让细胞在100?L分别包含了HBC-0、HBC-1、HBC-2、HBC-3和PEI材料的全培养基中，保持温度37℃的5%CO2培养箱中生长48h。同时，一组添加100?L不含其他材料的细胞在纯培养基中的自然生长设置作为空白对照。Hela细胞培养48h之后，将所有孔的培养液替换为20?LMTT溶液（5mg/mL），继续4h的孵化。结束后，每个孔中加入150?L的DMSO。最后，通过酶标仪（美国博腾仪器有限公司）测定各个孔中细胞在490nm波长的吸光度。各种材料不同浓度的细胞毒性都可以通过细胞存活率来体现，细胞的存活率（Cellviability）通过公式2来计算。

[Cell viability%=AsampleAcontrol×100%] 公式2

公式2中，Asample和Acontrol分别代表材料测试组与所设置的空白对照组的细胞在490nm波长的吸光度值。

2实验结果

2.1 HBC-X的制备

从图1中可以很清楚地看到，没有接受辐照的HBC溶液，是澄清无色的。经过1kGy的吸收剂量的辐照，HBC样品溶液的颜色变成了图中中间的浅黄色。而随着吸收剂量的增大，壳聚糖溶液的颜色越来越少，当HBC溶液样品被γ-ray辐照时，葡萄糖胺和N-乙酰葡萄糖胺单元的β（1-4）糖苷键断裂，使得HBC的主链发生了链断裂。另外，辐照过程通常伴随着一些氧化反应，产生含大量的羰基和羧基，导致了整个溶液的颜色变黄。

2.2 HBC-X的分子量

烏氏黏度计法测得辐照后HBC溶液样品的分子量如图2所示。

不同吸收剂量辐照过后的HBC样品测得的分子量，相比于原来的HBC-0，都有所降低。从图2上最左边，辐照之前的HBC-0组，分子量为35.0×104g·mol-1。吸收剂量为1kGy时，HBC样品的分子量已经降为HBC-1的30.16×104g·mol-1。要是剂量加大到3kGy，分子量就只剩下26.34×104g·mol-1。而HBC-10这组材料，吸收剂量10kGy的时候，壳聚糖降解更加的明显，分子量仅为19.27×104g·mol-1。HBC样品辐照后的分子量降低，说明辐照过程中被一定程度降解。并且可以看到这样的规律，随着吸收剂量的增加，降解的程度越高，分子量降低越发明显。

2.3 HBC-X与PEI的细胞毒性探究

对于吸收不同计量的辐照之后的产物（HBC-0、HBC-1、HBC-2、HBC-3）和PEI在不同浓度下的细胞毒性通过MTT法进行表征，结果如图3所示。

HBC-0组，也就是未经过辐照的羟丁基壳聚糖，细胞存活率都接近100%，即使浓度增大很多倍，细胞存活率也没有明显的降低。对于吸收一定剂量辐照之后的HBC，在0.5μg/mL的浓度下，HBC-1、HBC-2和HBC-3的细胞存活率分别是99.5%，97.3%和93.3%，远高于PEI组的60.8%。当HBC样品浓度从0.5μg/mL增大到10μg/mL，细胞存活率虽然有所降低，但是依然呈现比较健康的态势。而对HBC-2和HBC-3来说，虽然比HBC-0和HBC-1略有降低，但也呈现一样的趋势。而之所以细胞存活率有些许降低，可能是辐照过程中所产生的含羰基以及羟基的产物给细胞带来影响，而在相同的情况下，对比PEI组，它们的毒性非常惊人。PEI组即使在只有1μg/mL浓度下，大部分的细胞都会被杀死，假如PEI的浓度达到10μg/mL，那么，大多数细胞都会死亡，只剩下10%左右的细胞。这样的对比，也有力地体现了HBC作为生物材料的低细胞毒性，比起剧毒的PEI有更加广阔的临床应用前景。

3讨论

本文研究结果表明，羟丁基壳聚糖作为一种壳聚糖的衍生物，在具备温敏等其他功能的同时，辐射相关的性质依然比较优秀。虽然在辐照过程中，分子量会有少量的降低，但是如果辐照过程的吸收剂量不大的话，分子量降低程度较小。此外，HBC辐照之后的产物，依然具有非常低的细胞毒性，不会干扰Hela细胞的正常生长。因此，HBC作为一种温敏型生物材料的应用是比较可靠的。

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