盐酸溴己新葡萄糖注射液无菌检查方法研究

章瑛，张春华，刘彭浩邦，王杰，刘绪平

1.江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西 南昌 330029；2.江西中医药大学，江西 南昌 330103

盐酸溴己新葡萄糖注射液，适应证为慢性支气管炎及其他呼吸道疾病如哮喘、支气管扩张、矽肺等有黏痰而不易咳出者。还用于术后肺部并发症的预防治疗，术前呼吸道的廓清以及早产儿、新生儿及婴儿呼吸窘迫综合征的治疗，其药理作用主要是分解痰液中的黏多糖纤维，稀释痰液。机制是抑制杯状细胞和黏液腺体合成糖蛋白，使痰液中酸性糖蛋白线状网溶解低分子化，降低痰黏度，便于排出。促进胃黏膜反射性，引起呼吸道腺体浆液性分泌增加，恢复呼吸道分泌的正常流变，并增强气管纤毛运动，活化纤毛运输系统，廓清呼吸道［2-11］。

盐酸溴己新葡萄糖注射液通过静脉滴注进入血液直接起作用，根据《中国药典》（2015 年版）规定［1］，注射剂用于静脉注射的按照无菌制剂进行无菌检查。为保证无菌制剂达到无菌要求，确保患者用药安全，除了生产企业在生产、包装等过程严格控制外，还需要通过对药品进行无菌检测后确定其是无菌才能安全出售供用。参照《中国药典》（2015 年版）四部对于盐酸溴己新葡萄糖注射液无菌检查方法进行研究，建立本品的无菌检查方法。

1 实验仪器与培养基

1.1 仪器

生物安全柜 Heal Force-900C（上海力申科学仪器有限公司）；细菌培养箱SPL-250；霉菌培养箱3758CN；集菌仪 HTY-2000A；全封闭无菌检验过滤培养器（杭州泰林生物技术设备有限公司）。

1.2 培养基

见表1。

表1 培养基信息

1.3 试验菌株

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），CMCC（B）26003，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），CMCC（B）10104；大肠埃希菌（Escherichia coli），CMCC（B）44102；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），CMCC（B）63501，生 孢 梭 菌（Clostridium sporogenes），CMCC（B）64941，黑曲霉（Aspergillus niger），CMCC（F）98003；白色念珠菌（Candida albicans），CMCC（F）98001。菌种均来源于中国食品药品检定研究院。

1.4 样品

盐酸溴己新葡萄糖注射液（江西科伦药业有限公司，批号：B16051102，规格：100 mL:盐酸溴己新4 mg 与葡萄糖5 g）

2 方法

2.1 菌液的制备

分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌和大肠埃希菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，经33 ℃培养24 h 后，取新鲜培养物用pH 7.0 氯化钠蛋白胨缓冲液10 倍稀释，制成每1 mL 中含菌数小于100 cfu，备用。取黑曲霉接种至SDA 斜面上，经23 ℃培养1 周后，取新鲜培养物用3～5 mL 含0.05%吐温80 的0.9%无菌氧化钠溶液洗下黑曲霉孢子，吸取出孢子悬液1 mL，加上述稀释剂适量稀释，用标准比浊管比浊，其浊度与标准比浊管相当后，取1 mL 稀释后的孢子悬液，用上述稀释剂10 倍稀释，制成1 mL 含孢子数小于100 cfu 的孢子悬液，备用。取白色念珠菌接种于适量的SDA 中，经23 ℃培养3 d 后，取新鲜培养物用pH 7.0 氯化钠蛋白胨缓冲液10 倍稀释，制成每1 mL 中含菌数小于100 cfu，备用。上述试验菌株均为第2 代菌。

2.2 无菌方法的建立

2.2.1 预实验 按规定量取供试品，用薄膜过滤法处理，依法检查（《中国药典》 2015 年版四部通则1101）选用金黄色葡萄球菌（需氧菌）、白色念珠菌（真菌）作为敏感菌株进行预试验，结果详见表2 和表3。

表2 金黄色葡萄球菌结果

结合上述结果表明，盐酸溴己新葡萄糖注射液按规定量取样，按上述薄膜过滤法，金黄色葡萄球菌及白色念珠菌均可以正常生长。经无菌检查方法初步验证，本品无菌检查可采用薄膜过滤法（不冲洗）检验。

2.2.2 无菌方法适用性试验按批出厂检验量取样品，先将滤器用少量0.1%无菌蛋白胨水溶液润湿，使0.1%无菌蛋白胨水溶液顺利流出，将供试品溶液滤入滤器，滤干并将硫乙醇酸盐液体培养基或胰酪大豆胨液体培养基滤入滤器（每筒100 mL），分别加入少于100 cfu 的试验菌，置规定温度培养箱中培养，3～5 d 逐日观察。同时做阳性对照试验、阴性对照试验、试验菌平皿菌落记数，结果见表4和表5。

表4 菌落计数结果（cfu/mL）

表5 无菌方法适用性试验结果

3 讨论

根据2015 年版《中国药典》四部通则中对于注射剂的要求，用于皮下注射、皮内注射、肌内注射、静脉注射、静脉滴注等途径注入体内的注射液均应为无菌制剂，要求进行无菌检查。注射剂要保证无菌，首先要在规定的无菌保证水平采取充分验证后的灭菌生产工艺。在业界，常用“无菌保证水平”概念来评价灭菌工艺的效果，其定义为产品经灭菌后微生物残存的概率。该值越小，表明产品中微生物存在的概率越小。然而要想知道产品中是否还有微生物残存，就得对此产品建立无菌检查的方法，根据得出的方法对产品进行无菌检查，从而判断此产品是否为无菌。

结合上述的研究表明，盐酸溴己新葡萄糖注射液几乎无抑菌作用，在不用冲洗的情况下，各个菌株均能良好的生长。故此，盐酸溴己新葡萄糖注射液的无菌方法为薄膜过滤法，不冲洗，此方法可行，结果可靠。