黄皮酰胺生物电子等排体AchE 抑制剂的设计合成及分子对接研究

唐敏，徐芳辉，杨吟宇，晏莉莎，邓凤君

（益阳医学高等专科学校，湖南益阳 413000）

黄皮酰胺（Clausenmaide，CLA）是从芸香科植物黄皮（Clausenalansium）叶水浸膏中分离得到的一种吡咯烷酮类化合物[1]，有望开发成治疗老年痴呆症（Alzheimer's disease，AD）的新药[2-5]，其结构如图1 所示。CLA 化学结构包含4 个不对称碳原子，即8对对映体。其中(-)-CLA 和(+)-CLA 绝对构型分别为：3S，4R，5R，6S 和3R，4S，5S，6R。(-)-CLA结构具有两个疏水苯环且疏水性较强，使其容易进入中枢神经系统并通过血脑屏障发挥作用。研究表明，(-)-CLA 可以拮抗Aβ 诱导的PC12 细胞神经毒性和增强的基底突触传递[6]，可改善失忆症动物模型的学习和记忆[2,7]。目前，(-)-CLA 已完成Ⅰ期临床试验，正在准备Ⅱ期临床试验。

图1 黄皮酰胺结构

(-)-CLA 具有良好的促智作用，但(+)-CLA 没有促智作用[8]，表明黄皮酰胺的药理作用存在手性选择性。(-)-CLA 黄皮酰胺能改善樟柳碱所致的记忆障碍，这与其逆转樟柳碱引起的脑内乙酰胆碱含量降低作用相关[9]。同时研究发现CLA 的抑制AchE 作用也存在手性选择性，(-)-CLA 作用强于(+)-CLA[10]。

黄皮酰胺和合成路线最早由拜尔公司设计[11]，之后中国医学科学院药物研究所黄量院士设计出了黄皮酰胺的仿生合成路线[12]，该法以苯甲醛和氯乙酸甲酯为原料经Darzens 缩合、酯胺交换、氧化、环合等步骤生成外消旋黄皮酰胺酮，经重结晶分离得到黄皮酰胺酮，再经还原剂硼氢化钠的作用得到黄皮酰胺。目前，化合物(-)-CLA 可以人工合成[7]，其合成技术已获得美国专利批准[6]。

黄皮酰胺是一类γ-内酰胺环上发生多取代的2-吡咯烷酮类化合物，其结构中可供修饰的位置较多，其中7 位羟基就是一个值得改造的位置，因为黄皮酰胺所具有的促智和保肝作用与其7 位羟基的存在有着密切联系。根据生物电子等排原理[13]，羟基和氨基是一对经典的一价生物电子等排体，将黄皮酰胺7 位羟基用氨基替换后，可能得到与黄皮酰胺类似或更好药理活性的化合物。刘卡特反应（Leuckart-Wallach Reaction）不需要催化氢化就能一步直接将羰基转变为氨基[14]。该法原料易得，不需特殊设备，产品质量好，产率较高，反应所用的甲酸是一种可再生的还原剂，绿色环保[15]，其反应过程见图2。

图2 7-羰基的刘卡特反应

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

AQUITY UPLC/Q-TOF micro 质谱，美国Waters；AVANCE-300 核磁共振氢谱，德国Bruker；Vario EL元素分析仪，德国Elementar；JA1203 电子天平，上海恒平科学仪器有限公司；X6 型显微熔点测定仪，北京泰克仪器有限公司；RE-52A 型旋转蒸发器，巩义市予华仪器有限公司。

甲酸，分析纯，江苏强盛化工有限公司；氧化苯乙烯，分析纯，上海乙基化工有限供公司。的黄皮酰胺仿生合成路线合成[12]。

(±)-3-羟基-4-苯基-5-(甲酰氨基)苄基-N-甲基-2-吡咯烷酮的合成，在装有温度计、冷凝管、磁力搅拌装置的50 mL 三颈瓶中加入黄皮酰胺酮

1.2 目标化合物的合成

原料化合物3-羟基-4-苯基-5-苯甲酰基-N-甲基-γ-内酰胺（黄皮酰胺酮）按照黄量院士设计0.296 g（0.001 mol）、0.1 g MgCl2·H2O，加入2 mL甲酰胺（0.05 mol)、1mL 甲酸搅拌溶解，缓慢升温至130 ℃搅拌反应，TLC（硅胶GF254，乙酸乙酯∶石油醚=4 ∶1，紫外灯（UV）下观察）跟踪，1 h 后升温至165 ℃，反应5 h 后原料点消失。反应液中加入20 mL 蒸馏水搅拌10 min，然后用3×10 mL 二氯甲烷萃取水相，收集有机相，依次用4×50 mL 水、3×30 mL 饱和碳酸氢钠溶液、2×30 mL 饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥过夜，滤过，滤液减压蒸干得白色固体，乙酸乙酯重结晶得白色片状结晶0.203 g，产率63.7%，熔点（mp）212.3～213.2 ℃。

(±)-3-羟基-4-苯基-5-(氨基)苄基-N-甲基-2-吡咯烷酮的合成，在装有温度计、冷凝管、磁力搅拌装置的50 mL 三颈瓶中加入(±)-3-羟基-4-苯基-5-(甲酰氨基)苄基-N-甲基-2-吡咯烷酮0.324 g（0.001 mol）加入5 mL 无水乙醇溶解后，滴加浓盐酸0.15 mL，80 ℃条件下回流4 h 后出现白色沉淀，抽滤，滤渣用无水乙醇洗涤至中性后溶解于10 mL 蒸馏水中，过滤，往澄清溶液中加入20% NaOH溶液，调pH 至中性，析出沉淀，滤过，滤饼用乙酸乙酯重结晶得片状结晶0.207 g，产率68.5%，mp 195.8～196.5 ℃。

1.3 分子对接

从Protein Data Bank（PDB 库，http://www.rcsb.org）下载与多奈哌齐复合的乙酰胆碱酯酶（PDB ID：1EVE）的晶体结构[16]。本研究采用SYBYL-X 2.0 分子模拟软件，将复合物中的小分子配体抽离，删去水分子，生成结合口袋。随后进行分子结构优化、分子-配体对接以及相关评价。分子三维结构显示采用Chemdraw3D 软件，二维结构展示采用Chemdraw2D 软件。

2 结果与分析

2.1 化合物的结构鉴定

质谱、核磁共振氢谱、元素分析等数据与目标化合物结构一致，证实所得化合物结构正确。

(±)-3-羟基-4-苯基-5-（甲酰氨基）苄基-N-甲基-2-吡咯烷酮，m/z 325.15；元素分析（C）70.20、（H）6.21、（N）8.47；1H-NMR：2.841（s，3H，N-CH3），3.020（t，J=7.5 Hz，1H，C4-H），3.945（dd，J=7 Hz，1H，C3-H），4.072（dd，J=7 Hz，1H，C5-H），5.560（dd，J=10 Hz，1H，C7-H），5.936（d，J=4.5 Hz，1H，C3-OH，D2O 交换后消失），6.860～7.210（m，10H，Ar-H），8.248（s，1H，C8-H），8.831（d，J=10 Hz，1H，NH，D2O 交换后消失）。

（±）-3-羟基-4-苯基-5-（氨基）苄基-N-甲基-2-吡咯烷酮，m/z297.16；元素分析（C）72.98、（H）6.72、（N）9.30；1H-NMR：2.089（br，2H，NH2，D2O 交换后消失），2.907（s，3H，N-CH3），3.007（t，J=5.0 Hz，1H，C4-H），3.764（dd，J=5 Hz，1H，C3-H），3.798（d，J=5 Hz，1H，C5-H），4.379（d，J=3.0 Hz，1H，C7-H），6.00（br，1H，C3-OH，D2O 交换后消失），6.753-7.314（m，10H，Ar-H）。

2.2 分子模拟对接结果

分子对接打分结果见表1。可靠性验证结果显示，乙酰胆碱酯酶（PDB ID：1EVE）原配体多奈哌齐重新对接后发现其结合位置与原受体结晶中的配体位置几乎重叠，总得分（Total score）值为4.573 3。表明该对接实验所选用的蛋白晶体结构及所采用的对接方法均可靠，可用于黄皮酰胺类似物乙酰胆碱酯酶抑制活性的虚拟筛选。(-)-CLA 与乙酰胆碱酯酶结合对接效果强于(+)-CLA，这与文献[11]报道的结果一致。(-)-3-羟基-4-苯基-5-(α-氨基)苄基-N-甲基-2-吡咯烷酮Total score 高达6.092 1，超过了多奈哌齐的打分，(+)-3-羟基-4-苯基-5-(β-氨基)苄基-N-甲基-2-吡咯烷酮的打分为4.572 3，与多奈哌齐的打分非常接近。分子对接相互作用模式图见图3。

表1 分子对接结果

3 结论

图3 分子对接相互作用模式图

从已有黄皮酰胺抑制乙酰胆碱酯酶的生物活性出发，通过生物电子等排原理及Leuckart-Wallach 反应将3-羟基-4-苯基-5-苯甲酰基-N-甲基-γ-内酰胺6 位上的羰基改造成氨基，以期开发出活性更好的乙酰胆碱酯酶抑制剂。同时基于结构的配体设计原理，通过分子对接试验发现目标化合物3-羟基-4- 苯基-5-(β- 氨基) 苄基-N- 甲基-2- 吡咯烷酮与乙酰胆碱酯酶1EVE 对接效果较好。但Leuckart-Wallach 反应生成的胺类化合物为消旋体，其分离工作有待进一步的研究，此外通过分离得到的单体化合物还需要进行乙酰胆碱酯酶活性抑制试验确证。