基于毛细管电泳法测定天山堇菜中5 种活性成分的含量

阿曼·阿尔斯兰

（新疆药品审评查验中心，新疆乌鲁木齐 830054）

天山堇菜（Viola tianshanica）为多年生草本植物，属于堇菜科堇菜属，生长于海拔3 000 m 以上的山坡草地和高山，主要分布于中国新疆维吾尔自治区。天山堇菜作为维吾尔族医药在新疆被广泛使用，主要用于治疗感冒发烧、疔疮肿毒、祛风清热、淋巴肿大等[1]。天山堇菜全草中的活性成分主要包括挥发油[2]、氨基酸、香豆素类化合物[3]、生物碱和黄酮类化合物[4-5]。

随着现代分析技术的不断发展，现代分析仪器已逐步应用于中草药中活性物质的定性、定量分析中。刘丽霞等[6]使用高效液相色谱法对中药了哥王中伞形花内酯的含量进行了测定，结果表明，该方法适用于了哥王药材的质量控制，测得伞形花内酯质量浓度为0.6～24.0 mg/L。Miean 等[7]对62 种食用热带植物进行检测，发现洋葱中含有的黄酮类物质最多，其中槲皮素1 497.5 mg/kg，山柰酚832.0 mg/kg。张兰等[8]基于毛细管电泳-电化学检测法对中药石韦中的槲皮素和绿原酸进行了同时测定，在最优电泳介质下（pH 7.0，10.0 mmol/L 磷酸盐缓冲液）8 min内完全分离。马晓丽等[9]采用毛细管电泳法测定天山花楸中的黄酮类化合物，在缓冲体系为10 mmol/LNa2B4O7-20 mmol/LNaH2PO4的条件下对槲皮素、金丝桃苷和芦丁进行了检测，分离效果良好。曹炜等[10]使用HPLC 法对蜂胶中白杨素进行了测定，建立了一种灵敏、准确的分析方法，样品中白杨素的含量为2.3%～5.6%。

于健东等[11]为分离检测天山堇菜中的活性成分，通过HPLC 法测定维吾尔药天山堇菜中七叶内酯的含量，结果表明，天山堇菜中七叶内酯的平均含量为0.09%。用醋酸乙酯萃取天山堇菜中的活性成分，结合核磁共振得到了七叶内酯、白杨素、伞形花内酯和豆甾醇；用正丁醇萃取天山堇菜中的活性成分，成功地从正丁醇中分离得到了山柰酚、槲皮素和胡萝卜苷等物质。但目前，基于毛细管电泳法同时分离白杨素、伞形花内酯、七叶内酯、山柰酚和槲皮素的相关研究还鲜有报道。

本实验基于毛细管电泳技术，建立了一种能够同时检测分离白杨素、伞形花内酯、七叶内酯、山柰酚和槲皮素的方法，并将其用于天山堇菜实际样品的检测中。

1 材料与方法

1.1 实验材料

天山堇菜样品，购自新疆维吾尔自治区维吾尔医医院。

1.2 试剂与仪器

甲醇、乙腈、白杨素、槲皮素、山柰酚、伞形花内酯、七叶内酯，色谱纯，购自Sigma-Aldrich（美国）；氢氧化钠、硼砂等，分析纯，购自Sigma-Aldrich（美国）。

AP/ACETM MDQ 毛细管电泳系统，Beckman，配备有二极管阵列检测器（DAD）；熔融石英毛细管柱，永年锐沣色谱器件有限公司，使用32 Karat 软件处理数据；KQ-250B 型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；MilliQ-Gradient 超纯水系统，美国Millipore。

1.3 实验方法

毛细管柱为未涂层熔融石英毛细管，总长度为58.5 cm，内径为100 μm，有效长度为48.5 cm；对于新毛细管柱，先用色谱纯甲醇溶液冲洗10 min，然后用去离子水冲洗2 min，再用0.1 mol/L NaOH 溶液冲洗25 min，最后用去离子水冲洗5 min。

实验中采用的缓冲液为含20%乙腈的30 mmol/L的硼砂溶液。依次用0.1 mol/L NaOH、去离子水和缓冲液冲洗毛细管柱2 min，分离电压为12 kV，检测时间为30 min，0.5 psi（3.45 kPa）压力进样5.0 s，检测温度为25 ℃，检测波长为198 nm。

分别称取白杨素、山柰酚、槲皮素、伞形花内酯和七叶内酯的标准品各1.0 mg，用甲醇溶解，配制浓度为1 mg/mL 的标准储备液，4 ℃避光储存。用超纯水进行稀释，配制不同浓度的标准溶液。

取少量干燥的天山堇菜样品研磨至均匀的粉末，准确称取0.1 g 该样品于离心管中，加入10 mL 甲醇，超声提取30 min，离心，将上清液经0.22 μm 微孔滤膜过滤，备用，保存于4 ℃冰箱内。

1.4 方法学考察

在确定的电泳分离条件下，对本方法的精密度（日内精密度、日间精密度）、线性、重现性（日内重现性、日间重现性）、加标回收率进行考察。

1.5 天山堇菜中活性物质含量测定

在最优电泳分离条件下对天山堇菜样品中七叶内酯、伞形花内酯、山柰酚、白杨素和槲皮素进行检测。

2 结果与分析

2.1 标准品毛细管电泳图

5 种活性物质的电泳图如图1 所示，出峰顺序为白羊素、七叶内酯、伞形花内酯、山奈酚、槲皮素。

图1 标准品的毛细管电泳图

2.2 方法学考察

2.2.1 精密度

如表1 所示，各色谱峰日内精密度迁移时间的RSD不超过1.36%，峰面积的RSD不超过5.50%；日间精密度迁移时间的RSD不超过1.37%，峰面积的RSD不超过5.70%，日内精密度和日间精密度均良好。

2.2.2 线性考察本方法对5 种活性成分的线性关系如表2 所示，5 种成分均线性关系良好。

2.2.3 重现性考察

从表3 可以看出，日内重现性实验中，各色谱峰迁移时间的RSD不超过1.18%，峰面积的RSD不超过7.48%，日内重现性良好；日间重现性实验中，各色谱峰迁移时间的RSD不超过3.62%，峰面积的RSD不超过11.99%，日间重现性良好。

2.3 天山堇菜中活性物质含量测定

如图2 所示，天山堇菜中仅检测出七叶内酯、伞形花内酯和山柰酚3 种活性成分，白杨素和槲皮素未检出。为考察本方法的加标回收率，本实验根据5 种活性物质的含量对天山堇菜提取液进行加标。如表4所示，通过加标指认，天山堇菜提取液中含有七叶内酯、伞形花内酯和山柰酚，含量分别为20～50 μg/g、30～70 μg/g、220～250 μg/g。

表1 精密度考察结果

表2 线性关系考察

表3 重现性考察结果

表4 加标回收率检测（n=3）

图2 天山堇菜提取液毛细管电泳图

3 结论

本实验在在缓冲液为含20%乙腈的30 mmol/L的硼砂溶液，分离电压为12 kV，电泳时间为30 min，0.5 psi（3.45 kPa）压力进样5.0 s，紫外检测波长为198 nm，检测温度为25 ℃的电泳分离条件下下对天山堇菜中的白杨素、七叶内酯、伞形花内酯、山柰酚和槲皮素五种活性物质进行了测定。实验结果表明：天山堇菜中七叶内酯含量为20～50 μg/g，伞形花内酯含量为30～70 μg/g，山柰酚含量为220～250 μg/g。本实验基于毛细管电泳技术建立了一种快速、便捷的测定天山堇菜中活性成分含量的方法，同时，也为毛细管电泳技术在中草药中活性成分的含量的应用提供了研究依据。