不同海藻肥栽培料对平菇酶活力的影响

颜佳雯，朱长俊，王浩然，仵培，张琳，秦益民

（1.嘉兴学院生物与化学工程学院，浙江嘉兴 314001；2.农业农村部海藻类肥料重点实验室，山东青岛 266400；3.海藻活性物质国家重点实验室，山东青岛 266400）

传统的平菇栽培料通常以棉籽壳为主，但其运输成本较高，需找到其替代品以降低栽培成本。随着海藻工业的发展，越来越多的海藻渣被作为工业废渣排放至水中，与水形成胶性粘稠物，造成水体污染[2]。研究发现，海藻渣中含有较多营养成分，可用于平菇菌等食用菌的栽培，当海藻渣和棉籽壳比例为1 ∶1时，平菇菌丝蔓延速度最快，子实体多糖含量高达14.84%[3]。海藻渣还可以进一步提炼浓缩制成海藻肥，比化学肥料更能提高植物的光合作用，促进作物增产和早熟，提高抗逆能力，且绿色无公害，从而改善作物的品质[4-5]。目前，已有研究采用海藻肥培育火龙果、草莓、菠菜等[6-8]，但在栽培食用菌上还未得以应用。本研究用不同种类及不同浓度的海藻肥栽培平菇并对其酶活力进行测定，以找到最优配比为海藻渣的大规模生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

菌种为高平58（Pleurotusostreatus），本实验室保存；原料型、配合型、控释型、有机型和平衡型5 种海藻肥由青岛明月公司提供。

1.2 仪器与试剂

UV-1100 紫外分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；SBA1243 电子分析天平，上海昔今实验仪器有限公司；Eppendorf5810R 离心机，迪图（上海）生物科技有限公司。

无水乙醇，分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司；0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、DNS 显色剂、Tris 试剂，Scientific Phygene；30% H2O2，上海远大过氧化物有限公司。

1.3 配置培养基

如表1所示，为栽培料中海藻肥及棉籽壳的用量，此外，添加麦麸20 g、蔗糖1 g、氧化钙1 g。

表1 栽培料配比表

1.4 获取子实体

按表1 配方，配制8 种栽培料，湿度合适，pH 调至7。发酵24 h 后每种栽培料分装10 瓶，121 ℃灭菌2 h。菌饼法接种，置28 ℃培养，平菇长至八成熟时采收[9]。

1.5 酶活力测定

1.5.1 粗酶液制备

称取A 组新鲜子实体2 g 研磨，加入25 mL 0.05 mol/L 磷酸缓冲液（pH7.6），85 00 r/min 离心15 min，上清液作为酶提取液。其余各组依次重复上述实验，获得粗酶液。

1.5.2 过氧化氢酶

取8 支试管，各加0.1 mL 粗酶液，用相同条件下沸水浴10 min 灭活的粗酶液作对照。每支试管中加1.7 mL 蒸馏水、1.0 mL Tris-HCl 缓冲液，25 ℃水浴20 min 后，加0.2 mL 0.1 mol/LH2O2。每加完一管后立即计时，并迅速倒入石英比色杯中，240 nm 下测吸光度，每隔1min 读数1 次，测3 次[10-11]。一个酶活力单位（U）定义为：在上述试验条件下，每分钟引起OD 值改变0.1 所需的酶量。计算公式如式（1）所示。

式（1）中：t为反应时间；c为样品粗酶提取液体积与反应系统内粗酶提取液体积之比。

1.5.3 纤维素酶

取8 支试管，分别加入粗酶液1.0 mL，加入1%CMC-Na 溶液1.0 mL，50 ℃水浴30 min，加入2.0 mL DNS 试剂，沸水浴10 min，立即冷却，加蒸馏水定容至10 mL，混匀。8 组粗酶液相互对照，测定540nm 处吸光度值，绘制葡萄糖标准曲线计算葡萄糖含量，根据公式（2）计算酶活[12]。酶活定义为：1.0 mL 酶液1.0 min 催化纤维素生成1.0μmol 葡萄糖为1 个酶活单位，以U/mL 表示，

式（2）中，N表示粗酶液的稀释倍数；5.56 为还原糖的摩尔系数；A表示由吸光度从标准曲线上查得的葡萄糖浓度；V表示酶解反应之后试管内溶液体积；T表示反应时间；V1表示所加酶液体积。

1.5.4 淀粉酶

取8 支试管，分别取2 mL 的粗酶液于试管中，再分别加入1 mL DNS 试剂后至40 ℃的水浴中5 min，定容至25 mL，在520 nm 波长下测吸光度。定义以1 mL 的粗酶液中的淀粉酶，在40 ℃温度下1 min 生成0.1 mg 的还原糖为1 个活力单位（U）。计算公式如式（3）所示。

式（3）中，C为测定的还原糖产量，7 为定值，2 为加入的粗酶液，0.1 为1 min 生产0.1 mg 的还原糖，5 为水浴时间。

1.5.5 漆酶

取9 支试管，分别移取1 mL 粗酶液置试管中，其中一支试管通过沸水浴灭活，作为对照。反应体系为1 mL 粗酶液加入2 mL 0.25 mmol/L 的ABTS 缓冲液，反应3 min，分光光度计在410 nm波长处测OD值。定义每分钟使OD 均值增加0.1 所需的酶量为1 个酶活力单位（U），用公式（4）计算漆酶活力。

式（4）中：A为3 min 吸光度；t为反应时间的变化量，min；V1为反应总体积，mL；V2为测定酶活力时所取的酶液体积，mL；ε为3.6×104mol/(L·cm)；N为酶液稀释倍数。

2 结果与分析

2.1 海藻肥用量对平菇子实体酶活的影响

8 个栽培组4 种酶活测定结果如图1 所示：对比使用同一浓度的海藻肥栽培组可得出，A 组和D组使用的海藻肥其测得的过氧化氢酶、纤维素酶活力高于空白组测得的结果，其中D 组比空白组H 过氧化氢酶活力提高了24.26%，纤维素酶活力提高了22.35%，但E、G 组测得的过氧化氢酶活力明显低于空白组，即起到了一定的抑制作用，其中E 组的抑制作用最明显，过氧化氢酶活力低了21.2%，纤维素酶活力低了21.97%，A 组和F 组使用的海藻肥其测得的漆酶活力高于空白组测得的漆酶活力，其中A 组比空白组H 漆酶活力提高了38.43%，但D、E、F 组测得的漆酶活力明显低于空白组即起一定的抑制作用，其中D 组的抑制作用最明显，酶活力低了28.59%。

图1 原料型海藻肥用量对平菇子实体酶活的影响

2.2 海藻肥类型对平菇子实体酶活的影响

将原料型海藻肥实验组按添加量不同分为A、B、C 组，其中B 组测得的过氧化氢酶活力比空白组提高了18.62%，纤维素酶活力比空白组提高了15.36%，漆酶活力比空白组提高了69.95%，可推断出100 g 栽培料中加入的原料型海藻肥高于10 g 可能会对过氧化氢酶、纤维素酶和漆酶活力均起抑制作用。对于淀粉酶活力而言，本次使用的海藻肥对淀粉酶活力均起抑制作用。

图1 海藻肥类型对平菇子实体酶活的影响

3 结论

海藻肥用量及海藻肥种类对平菇子实体的酶活力均有影响：控释型和平衡型海藻肥不适合用来提高平菇酶活力即平菇的生长能力，原料型和配合型则较适合添加在平菇栽培料中，后续可继续进行重复实验深入测定；不同浓度海藻肥对平菇内的酶活力影响有一定差异，以原料型海藻肥为例，100 g 栽培料中添加10 g 海藻肥时平菇酶活力最强，100 g 栽培料中添加高于15 g 海藻肥则会对平菇酶活力起一定的抑制作用。