乙酰半胱氨酸微生物限度方法学验证

王淑玲

（1.扬子江药业集团南京海陵药业有限公司，江苏南京 210000；2.南昌大学，江西南昌 330000）

N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）是含巯基（-SH）的还原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）前体，曾用作黏液溶解剂和对乙酰氨基酚中毒的治疗[1]。其在调节免疫、抗感染、抗毒素等领域中也具有独特优势。本文基于《中国药典》2015 版对该药品的微生物限度检查方法进行了验证。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

LRH－150、MJ150-1 生化培养箱，上海索谱仪器有限公司；XG1.G 脉动真空灭菌器，山东新华医疗器械股份有限公司；1384-A2 生物安全柜，赛默飞；PL202-L 电子天平，METTLER TOLEDO；EZ 自动微生物过滤检验装置，密理博。

乙酰半胱氨酸（批号201904014、201905008、201908005），武汉远大弘元股份有限公司。

1.2 菌种与培养基

金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、白色念珠菌[CMCC （F)98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]、大肠埃希菌[CMCC（B）44102]，北京三药科技开发公司。

胰酪大豆胨液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基，北京三药；胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖液体培养基，青岛日水生物技术有限公司；麦康凯液体培养基、麦康凯琼脂培养基，BD；pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（以下简称缓冲液），扬子江药业集团。

1.3 溶液制备

接种金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35 ℃培养18～24 h；接种大肠埃希菌液体培养物胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35 ℃培养18～24 h，接种白色念珠菌液体培养物至沙氏葡萄糖液体培养基，于20～25 ℃培养18～24 h，分别将金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌培养物用缓冲液制成含菌数≤10 000 cfu/mL 的菌悬液，将大肠埃希菌培养物制成含菌数≤100 cfu/mL 的菌悬液。接种黑曲霉培养物至沙氏葡萄糖琼脂培养基，于20～25 ℃培养5～7 d，加入含0.05%的聚山梨酯80 的缓冲液，制成含菌数≤10 000 cfu/mL 的菌悬液。

取样品10 g，加90 mL 缓冲液，再加入6 mol/L 的氢氧化钠溶液10 mL，充分混匀，制成1 ∶10 的供试液，用缓冲液稀释制成1 ∶50 的供试液。

1.4 需氧菌总数检查验证（薄膜过滤法）

1.4.1 试验组

取1 ∶50 的供试液9.9 mL 和≤10 000 cfu/mL的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌等菌悬液、黑曲霉孢子悬液0.1 mL 混匀后，取1 mL 加入约50 mL 缓冲液过滤（滤膜已用50 mL 缓冲液润湿），冲洗5 次，每次100 mL。取出滤膜，菌面朝上，贴于胰酪大豆胨琼脂培养基上，于30～35 ℃倒置培养不超过3 d，过滤白色念珠菌菌悬液、黑曲霉孢子悬液的平皿于30～35 ℃倒置培养不超过5 d，点计菌落数。

1.4.2 菌液组

取缓冲液9.9 mL，其他均同试验组操作方法。

1.4.3 供试品对照组

取缓冲液50 mL 和1 ∶50 供试液1 mL，过滤、冲洗5 次，每次100 mL。取出滤膜，菌面朝上，贴于胰酪大豆胨琼脂培养基上，于30～35 ℃倒置培养不超过3 d（操作方法同试验组），点计菌落数。

1.4.4 阴性对照组

取缓冲液50 mL，过滤、冲洗5 次，每次100 mL。取出滤膜，菌面朝上，贴于胰酪大豆胨琼脂培养基上，于30～35 ℃倒置培养不超过3 d（操作方法同试验组），点计菌落数。

1.5 霉菌和酵母菌总数检查验证（平皿法）

1.5.1 试验组

取1 ∶10 的供试液9.9 mL 分别和白色念珠菌悬液（含菌数≤10 000 cfu/mL）及黑曲霉孢子悬液（含孢子数≤10 000 cfu/mL）各0.1 mL 混匀，吸取1 mL 加入平皿中，加入45 ℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基15～20 mL，混匀，凝固，于20～25 ℃倒置培养不超过5 d，点计菌落数。

1.5.2 菌液组

取缓冲液9.9 mL，其他均同试验组操作方法。

1.5.3 供试品对照组

取1 ∶10 的供试液1 mL 加入平皿中，加入45 ℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基15～20 mL，混匀，凝固，于20～25 ℃倒置培养不超过5 d，点计菌落数。

1.5.4 阴性对照组

取缓冲液1 mL 加入平皿中，加入45 ℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基15～20 mL，混匀，凝固，于20～25 ℃倒置培养不超过5 d，点计菌落数。

1.6 控制菌-大肠埃希菌检查验证（薄膜过滤法）

1.6.1 阳性对照组

取1 ∶10 的供试液10 mL 和缓冲液50 mL，用已润湿滤膜过滤、冲洗（每次100 mL，冲洗3 次），在最后一次冲洗液中加入不大于10 000 cfu/mL 的菌悬液1 mL，冲洗结束后，取出滤膜，接种至100 mL 胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35 ℃培养18～24 h，备用。

1.6.2 供试品对照组

取1 ∶10 的供试液10 mL 和缓冲液50 mL，用滤膜（已用50 mL 的缓冲液润湿）过滤、冲洗（每次100 mL，冲洗3 次），冲洗结束后，取出滤膜，接种至100 mL 胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35 ℃培养18～24 h，备用。

1.6.3 阴性对照组

取缓冲液50 mL，用滤膜（已用缓冲液润湿）过滤、冲洗（每次100 mL，冲洗3 次），冲洗结束后，取出滤膜，接种至100 mL 胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35 ℃培养18～24 h，备用。

1.7 回收率计算

根据公式（1）计算回收率。

2 结果与分析

需氧菌总数检查验证（薄膜过滤法）结果见表1，霉菌和酵母菌总数检查验证（平皿法）结果见表2，控制菌-大肠埃希菌检查验证（薄膜过滤法）结果见表3。回收率数据表明，需氧菌检查、控制菌检查采用薄膜过滤法，霉菌和酵母菌数检查采用平皿法，试验菌的回收率均在0.5～2.0，方法准确度高。

表1 需氧菌总数检查验证结果

表2 霉菌和酵母菌总数检查验证结果

表3 大肠埃希菌检查验证结果

3 结论

乙酰半胱氨酸的需氧菌检查、控制菌检查采用薄膜过滤法，霉菌和酵母菌数检查采用平皿法，试验菌的回收率均在0.5～2.0，方法可行。