肌原纤维蛋白-油茶籽油稳定乳化液制备及特性分析

陈利华,陈小草,林鸿瀚,陈 红,丁玉庭,3,4,周绪霞,3,4

(1.绍兴市白马湖食品有限公司,浙江 绍兴 312367;2.浙江工业大学 食品科学与工程学院,浙江 杭州 310014;3.浙江省深蓝渔业资源高效开发利用重点实验室,浙江 杭州 310014;4.国家远洋水产品加工技术研发分中心(杭州),浙江 杭州 310014)

鱼糜是一种具有优良弹性的凝胶体,其凝胶品质受许多因素的影响,其中,外源油脂的添加会极大地影响鱼糜的流变性和微观结构,进而影响鱼糜的品质特性[1-4]。与直接添加油脂相比,预乳化处理更有利于油脂在凝胶中的均匀分布[5],而乳化液的物理化学性质及其界面结构,包括乳化后的尺寸大小和油滴的存在环境等,会影响油脂-油脂及油脂-蛋白之间的界面性质,并进一步影响乳化液及其在凝胶中的稳定性[2]。蛋白质是一种天然的食品乳化剂,可吸附在油水界面,降低界面张力,并通过疏水相互作用力和静电相互作用起到稳定乳液体系的作用[6-8]。但蛋白质乳化性受蛋白质表面疏水性、蛋白质粒径、活性巯基含量等多种因素的影响[9-10]。在蛋白质稳定的乳化液体系中,乳化液的稳定性主要取决于蛋白质的界面性质以及油-水界面处蛋白吸附成膜的黏弹性,通过增加界面中吸附蛋白量可以有效改善乳化液稳定性[11-12]。肌原纤维蛋白是鱼肉的主要成分,由肌球蛋白、肌动蛋白和肌动球蛋白等盐溶性蛋白组成,在凝胶化和乳化中起重要作用[13-15]。同时,肌原纤维蛋白也是一种优良的蛋白质乳化剂。Shi等[16]研究表明:将肌原纤维蛋白、油和水混合后进行高压均质化处理时,肌原纤维蛋白会吸附至油滴界面形成界面蛋白膜,使其张力降低,促进油滴在水相中的分散,同时油滴界面上的蛋白质保护层可以在一定程度上抑制油滴的凝结。乳液特性受体系成分、蛋白质和油脂浓度、制备方法等多方面影响[17]。Chung等[18]研究证明了油滴浓度对液态奶精的外观、黏度和稳定性有重要作用;Saeidy等[19]的研究也表明油体积分数的增大增强了乳液的稳定性。

本课题组前期研究表明油茶籽油乳化液对鱼糜制品特性有影响,但研究中也发现肌原纤维蛋白作为蛋白质表面活性剂,其浓度及其与油茶籽油的配比会直接影响乳化液的稳定性及其在鱼糜体系中的稳定性[2]。因此,笔者以油茶籽油为研究对象,以肌原纤维蛋白为蛋白乳化剂对油茶籽油进行预乳化,分析肌原纤维蛋白质量浓度和油茶籽油质量分数对乳化液乳化稳定性、界面流变性、表面巯基和总巯基含量等的影响,为高品质鱼糜制品的制备提供理论依据。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料与试剂

新鲜鲢鱼购于当地市场;油茶籽油(不含胆固醇和黄菌霉素,杭州久晟生物科技有限公司)购于当地超市;十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠和Tris均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Ultra-Turrax乳化均质机,德国IKA;CR21GⅡ高速冷冻离心机,日本日立公司;MCR52高级拓展流变仪,奥地利安东帕有限公司;UV759紫外分光光度仪,上海奥普勒仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 肌原纤维蛋白制备

参照Sun等[20]的方法并适当修改,制备鲢鱼肌原纤维蛋白。鱼去皮和内脏后清水洗净,取鱼肉剪碎放入烧杯中,加入4倍体积的冰磷酸盐缓冲溶液(0.025 mol/L Na2HPO4和0.025 mol/L NaH2PO4混合液,pH 6.8),倒入搅拌机中匀浆,然后4 ℃,12 000 r/min离心15 min,去除上清液,取沉淀。沉淀物中加入4倍体积的冰磷酸盐缓冲液匀浆,匀浆液用2层纱布过滤,保留滤液,滤液离心后去除上清液,沉淀用4倍体积的0.1 mol/L冰NaCl溶液冲洗,离心所得沉淀物即为鱼糜肌原纤维蛋白。通过双缩脲法测定蛋白质质量浓度,置于4 ℃冰箱备用,蛋白质质量浓度以冰磷酸盐缓冲溶液(0.05 mol/L Na2HPO4和0.05 mol/L NaH2PO4混合液,pH 6.8)调节。

1.3.2 乳化液的制备

以1.3.1制备的肌原纤维蛋白为乳化剂对油茶籽油进行乳化,研究不同肌原纤维蛋白质量浓度和油茶籽油质量分数对乳液的影响。根据前期预实验结果,将乳化液分2组:1)控制乳液中油茶籽油质量分数为20%,NaCl浓度0.6 mol/L,蛋白质质量浓度分别设定为30,60,90,120 mg/mL,混合后分别于10 000 r/min乳化均质1 min;2)控制乳液中蛋白质质量浓度为90 mg/mL,NaCl浓度为0.6 mol/L,油茶籽油质量分数分别设定为5%,10%,20%和30%,混合后分别于10 000 r/min乳化均质1 min。得到乳化液后立即进行相关指标的测定。

1.3.3 乳化活性和乳化稳定性测定

20 μL乳化液中加入5 mL 0.1% SDS溶液后混合均匀,在500 nm处测定吸光值,记为A0。乳化液静置10 min后采用相同的方法测定乳化液吸光值,记为A10,以0.1% SDS溶液作空白对照。乳化活性指数(Emulsifying activity index,EAI)和乳化稳定性指数(Emulsifying stability index,ESI)计算公式[21]为

(1)

(2)

式中:T=2.303;N为稀释倍数;C为乳状液形成前蛋白质水溶液中蛋白质质量浓度,g/mL;φ为乳状液油相的体积分数。

1.3.4 表面巯基和总巯基摩尔质量比率的测定

参考Plancken等[22]的方法并略作修改。

1)表面巯基摩尔质量比率的测定:取1 mL样品溶液,加入4 mL Tris-甘氨酸缓冲液(0.01 mol/L EDTA,pH 8.0)和125 μL DTNB(20 mg DTNB溶于5 mL 0.1 mol/L的Tris-甘氨酸缓冲液,pH 8.0),混合均匀后在25 ℃下静置15 min,测定在412 nm处的吸光值。

2)总巯基摩尔质量比率的测定:取1 mL样品溶液,加入4 mL Tris-甘氨酸缓冲液(0.01 mol/L EDTA,0.25% SDS,pH 8.0),混合均匀后按照表面巯基摩尔质量比率的测定方法测定。巯基的摩尔质量比率SH的计算公式为

(3)

式中:A412为样品溶液在412 nm处的吸光值;C为样品质量浓度,mg/mL;D为样品稀释倍数,取5.125。

1.3.5 界面剪切流变性质测定

界面剪切流变性分别通过稳态和动态2种模式扫描,测定温度25 ℃。稳态剪切扫描测定不同剪切速率下乳化液的剪切黏度,剪切速率为0.01～1 000 s-1。动态振荡模式实验先进行0.01%～100%范围的应变扫描,固定频率为1 Hz,之后根据扫描结果确定线性黏弹区并选择合适的应变值进行动态频率扫描,频率扫描范围为0.1～10 Hz,测量储能模量G′在0.1%应变下的频率的函数曲线。

1.4 统计分析

采用Excel 2013进行数据整理,SPSS 19.0进行方差分析,Duncan法进行多重比较(P<0.05表示差异显著),Origin 8.6绘图。

2 结果与分析

2.1 肌原纤维蛋白质量浓度对乳化液特性的影响

2.1.1 肌原纤维蛋白质量浓度对乳化液EAI和ESI的影响

乳化特性是蛋白质主要的功能特性之一,EAI和ESI是衡量蛋白质乳化特性的重要指标。肌原纤维蛋白质量浓度对乳化液乳化活性和乳化稳定性的影响见图1。

图1 肌原纤维蛋白质量浓度对乳化液乳化活性和乳化稳定性的影响

由图1可知:随着蛋白质质量浓度升高,乳液的EAI显著降低,ESI呈现先增加后降低的趋势(P<0.05)。当蛋白质质量浓度从30 mg/mL增加到120 mg/mL时,EAI从0.40 m2/g降到0.19 m2/g,与Agyare等[23]对胰凝乳蛋白酶水解小麦面筋的研究结果一致。一般认为:EAI对蛋白质质量浓度的依赖性可用吸附动力学解释,在低蛋白质量浓度下,蛋白质的快速吸附使油-水界面处蛋白质扩散系数增大,油相和水相之间的相互作用增强,而在高蛋白质量浓度下,蛋白质因活化能障碍无法以扩散依赖性方式迁移而降低了乳化活性[24]。同EAI变化趋势不同,随着蛋白质质量浓度从30 mg/mL增加到120 mg/mL时,ESI从15.70 min增加到60.09 min,最后降到52.72 min,呈现先增加后降低的趋势(P<0.05)。ESI升高可能与油脂和蛋白质之间界面膜厚度的增加有关。但当蛋白质质量浓度在120 mg/mL时,蛋白质在吸附过程中形成多层吸附结构,过多的蛋白质会以松散方式参与到多层吸附结构的形成中,导致蛋白质乳化稳定性的降低[25]。研究也表明分子吸附过程中蛋白质结构的展开会增强分子间相互作用而导致蛋白分子之间交联絮凝[26]。

2.1.2 肌原纤维蛋白质量浓度对乳化液中游离巯基和总巯基的影响

巯基对蛋白质功能特性有很大影响,肌原纤维蛋白质量浓度对乳化液游离巯基和总巯基摩尔质量比率的影响见图2。随着乳液中蛋白质质量浓度的升高,游离巯基和总巯基摩尔质量比率均显著降低(P<0.05)。其中总巯基由8.89 μmol/g降到4.30 μmol/g;游离巯基由4.55 μmol/g降到1.82 μmol/g,但游离巯基摩尔质量比率在蛋白质质量浓度为60 mg/mL和90 mg/mL时无差异(P>0.05)。一般认为是巯基的氧化和二硫键的生成导致了游离巯基和总巯基的减少[27]。二硫键是维持天然蛋白质致密结构的重要化学键,其适量形成可以在一定程度上提高乳化液的稳定性。因此,在一定的蛋白质质量浓度范围内,随着蛋白质质量浓度的升高,乳化液游离巯基摩尔质量比率降低,乳化液稳定性增加,与ESI的研究结果一致[16]。

图2 肌原纤维蛋白质量浓度对乳化液游离巯基和总巯基的影响

2.1.3 肌原纤维蛋白质量浓度对乳化液界面流变性的影响

乳化液的黏度随剪切速率的变化曲线见图3。由图3可知:肌原纤维蛋白乳化液存在“剪切稀化”行为[28],随着剪切速率的增加,分子间相互作用减弱,流动阻力减小,乳液黏度下降并最终趋于稳定,导致乳液在一定剪切速率下流动更加有序。相同剪切速率下,蛋白质质量浓度越高,蛋白质间作用力越强,乳液黏度越大,乳液也更加稳定[29]。

图3 乳化液的黏度随剪切速率的变化曲线

随着剪切速率的增加,不同质量浓度的肌原纤维蛋白乳化液的储能模量G′随频率的加大逐渐增加,肌原纤维蛋白质量浓度对乳化液G′的影响见图4。当乳化液中肌原纤维蛋白质量浓度为120 mg/mL时,G′最大。G′升高的原因可能是由于蛋白质之间或蛋白质包裹油滴之间的疏水相互作用和二硫键的交联作用的增强[8]。当乳化剂(即蛋白质)质量浓度较高时,乳化剂快速吸附到界面上,继而展开重排,完全覆盖在油滴表面,紧密排列的界面膜的黏弹性、厚度增加,乳化液趋于形成弱凝胶结构[30-31]。

图4 肌原纤维蛋白质量浓度对乳化液G′的影响

综合各项指标,当蛋白质质量浓度为90 mg/mL时肌原纤维蛋白乳化液具有较强的剪切稀化能力,在剪切过程中流体组织较有序,且界面膜的黏弹性和稳定性较高[32],因此在接下来的实验中设定肌原纤维蛋白质量质量分数为90 mg/mL,进一步研究油脂质量分数对乳液稳定性的影响。

2.2 油脂质量分数对乳化液特性的影响

2.2.1 油脂质量分数对乳化液EAI和ESI的影响

油脂质量分数对乳化液乳化活性和乳化稳定性的影响见图5。由图5可知:当油脂质量分数从5%增加到30%时,EAI从0.40 m2/g降到0.17 m2/g,呈显著降低趋势(P<0.05)。在一定蛋白质质量浓度下,乳化液在高油相体积分数时形成的油相表面积较小。添加油脂为蛋白质提供一个疏水环境,随着油脂质量分数增大,蛋白质疏水基团被埋藏,致使其表面疏水性降低,进而降低乳化液的乳化活性。乳化液乳化稳定性随油脂质量分数增大呈现先增加再降低的趋势(P<0.05),当油脂质量分数为20%时,乳化液稳定性最高。较高的油脂质量分数可增加乳化液的黏度,进而提高其乳化稳定性,但当油脂质量分数已达到饱和后继续增大其质量分数,会导致乳化剪切过程中蛋白质无法包裹住过多的油脂,蛋白界面膜被打破,引起油脂颗粒碰撞聚集增大,从而降低乳化液的稳定性。

图5 油脂质量分数对乳化液乳化活性和乳化稳定性的影响

2.2.2 油脂质量分数对乳化液游离巯基和总巯基的影响

油脂质量分数对乳化液游离巯基和总巯基的影响见图6,游离巯基和总巯基的摩尔质量比率均随油脂质量分数增加呈先降低后增加趋势,当油脂质量分数分别为10%和20%时,游离巯基和总巯基的摩尔质量比率最低。油脂质量分数过大时,乳化液中油脂与水相中助氧化剂的接触面积增大,同时表面界面膜的产生会使蛋白质构象发生变化,多肽链展开,增加巯基暴露程度,使更多巯基氧化为二硫键[17]。笔者推测:当油脂质量分数为20%时,蛋白质分子内部或分子间的一部分巯基发生的氧化反应或巯基/二硫键的交换反应最强,体系中二硫键浓度最高,乳化液乳化稳定性也相对最高。

图6 油脂质量分数对乳化液游离巯基和总巯基的影响

2.2.3 油脂质量分数对乳化液界面流变性的影响

不同质量分数油脂乳化液的黏度随剪切速率的变化见图7。由图7可知:相同剪切速率下,油脂质量分数越大,乳液黏度越大。在较大油脂质量分数(20%和30%)下,油脂质量分数越高,乳化液的黏度随剪切速率(0～600 s-1)的增加下降得越快。5%和10%油脂质量分数下的乳化液曲线十分接近,且黏度变化不大,表明油脂对乳液黏度的影响与蛋白质相似,存在“剪切稀化”行为[28]。

图7 不同质量分数油脂乳化液的黏度随剪切速率的变化曲线

油脂质量分数对乳化液G′的影响见图8。由图8可知:乳化液的G′随着油脂质量分数增大而增加。粒径大小、界面膜强度、分散相和连续相的黏度以及密度差等均会影响乳化液的稳定性,但蛋白质的界面性质以及油-水界面处蛋白吸附成膜的黏弹性是其中的主要影响因素[33-36]。添加具有黏弹性的油脂,可以增加乳化液中分散相的黏度。笔者实验中,随着油脂质量分数的升高,蛋白质与油脂两者间逐渐达到饱和,形成的界面膜不断增厚,有利于稳定油滴颗粒。但当油脂质量分数过高时,蛋白质界面膜无法包裹住油滴,油滴之间易凝结从而不利于乳化液的稳定。综合分析,当油脂质量分数为20%时得到的乳化液黏度较高,储能模量也越高,得到的乳化液更稳定。

图8 油脂质量分数对乳化液G′的影响

3 结 论

重点分析了蛋白质乳化剂的质量浓度和油脂质量分数对油茶籽油乳化液稳定性的影响。研究结果表明:一定范围内,蛋白质乳化剂质量浓度的增加可以在一定程度上增加蛋白质-油脂界面膜的厚度,提高界面膜和蛋白质乳化稳定性,但过高的蛋白质质量浓度会引起蛋白质在水相中的积累而降低乳化液的稳定性。增大油脂质量分数会提高乳化液的黏度,进而提高乳化液的乳化稳定性,但是在油脂质量分数达到20%后,继续添加油脂,会因在乳化剪切过程中蛋白质无法包裹住所有的油脂而使蛋白界面膜被打破,导致油脂颗粒因碰撞聚集而体积增大,降低乳化液的稳定性;在肌原纤维蛋白质量浓度90 mg/mL、油脂质量分数为20%时,可以得到稳定性较好的乳化液,研究结果可以为通过在鱼糜中添加油脂改善其营养和品质提供理论依据和数据基础。