一种改善肠道菌群乳酸菌豆粉颗粒冲剂工艺的制备方法

赵舒欣,贺蓓蓓,曾玉洁,彭晓顺,王红丁,宋园亮

(1.湖北医药学院 第一临床学院,湖北 十堰 442000;2.湖北医药学院 药学院,湖北 十堰 442000;3.湖北医药学院 第四临床学院,湖北 十堰 442000;4.湖北医药学院 科技处,湖北 十堰 442000)

居住在人类肠道中的微生物种类极多、数量极大,其中以乳酸菌为代表的益生菌在维护肠道健康中发挥着重要作用[1-2]。现代生活节奏加快、工作压力增大、不健康饮食、环境污染、抗生素滥用和年龄增长等因素导致人体肠道有益微生物数量减少,造成肠道菌群结构失衡,进而引发肥胖、肠炎和糖尿病等各种健康问题[3-5]。笔者利用自主筛选的高活性乳酸菌发酵大豆,经过低温烘干、研磨和制粒工艺制成了乳酸菌豆粉颗粒冲剂,能补充人体乳酸菌、提供营养物质及功能性成分,口感良好,易被大众所接受,便于携带储存,帮助调整人体肠道菌群平衡,较好地维护人体肠道健康[6-9]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验材料

高活性乳酸菌菌株[10],实验室保存;大豆、绵白糖、纯净水、淀粉、麦芽糊精、碳酸钙和淀粉浆,市售。

1.1.2 试 剂

0.9%的生理盐水。

1.1.3 培 养 基

MRS培养基,北京奥博星生物技术有限责任公司;MRS肉汤培养基,北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.1.4 仪器与设备

NewClassic MF MS304S电子分析天平,梅特勒-托利多集团;HCB-1300V垂直层流洁净工作台,Haier;DHG-9243BS电热恒温鼓风干燥箱,上海新苗医疗器械制造有限公司;THZ-82B气浴恒温振荡器,常州市国旺仪器制造有限公司;MLS-3781L高压灭菌器,Panasonic公司;SPH-2102C新颖立式小容量恒温摇床,上海世平实验设备有限公司;BIO-RAD C1000 Touch PCR仪,美国伯乐公司;Eppendorf Centrifuge 5424R小型冷冻高速离心机,德国艾本德股份公司;MK-2O干式恒温器,杭州奥盛仪器有限公司;制药用50目筛网,粉碎机。

1.2 检测方法

1.2.1 产品感官评价

依据感官指标[11],由专业人员组成5人品赏小组,采用100分制评分,然后取平均值。评分标准:色泽20分,外部形态20分,组织状态30分,滋味口感30分。

1.2.2 制粒效果评价

制软材是挤出法制粒中最关键的一步,判断标准为“手捏成团,轻按即散”或“握之成团、轻压即散”。制粒时,若软材过黏则软材形成团块不易压过筛;软材太干,软材通过筛网后呈疏松的粉粒或细粉过多;软材过软,制粒时软材易黏附或压出的颗粒成条状。仍由专业人员组成5人品赏小组,采用110分制评分,然后取平均值。评分标准:溶解度30分,流动性20分,硬度30分,粒度分布30分。软材黏合度按太差、差、中等、较好和好指标评价;软材通过筛网后余下的细粉量按几乎无、少、较少、中等和多指标评价;颗粒长度按短、中等、较长和长指标评价。软材黏合度、细粉量和颗粒长度由品赏小组共同评价。

1.2.3 测定方法

酸度(°T)采用浓度0.1 mol/L的NaOH滴定法测定;pH采用PHS-2型酸度计测定[12];活性乳酸菌按平板菌落计数法进行测定。

1.3 基本配方与工艺流程

经乳酸菌发酵后烘干,按m(豆粉)∶m(绵白糖)∶m(淀粉)=2.0∶1.0∶1.0配制成基本配方[13],乳酸菌豆粉颗粒冲剂制作的工艺流程[14]如图1所示。

图1 乳酸菌豆粉颗粒冲剂制作的工艺流程

1.4 操作要点

1.4.1 发酵豆粉的制作

取100 μL乳酸菌菌液接种到5 mL灭菌液体MRS培养基内复壮,37 ℃恒温培养36～48 h,培养完成后再接种于500 mL MRS液体培养基,在中扩培36～48 h,同时放置另一未接种的500 mL MRS液体培养基,在相同条件下培养做对照实验。若扩培完成后,已接种的培养基浑浊,而未接种的培养基依旧清亮,则扩培成功,未经污染。扩培操作便于提供大量而新鲜的、具有较高活力的菌种,从而缩短发酵周期,抑制杂菌的生长,减少污染的机会。首先,离心提取乳酸菌菌种,溶于50 mL生理盐水[15];然后,将洗净的大豆沥干后置于不锈钢盆中,纱布封装,121 ℃,15 min高压杀菌,杀菌结束后冷却至常温;最后,将溶有乳酸菌的生理盐水与大豆混合均匀,于培养箱中37 ℃发酵48 h,乳酸菌完全依靠大豆生长,无需添加其他物质即可完成发酵[16]。发酵完成后,置于电热恒温鼓风干燥箱中40 ℃烘干,用粉碎机研磨成细腻粉状,备用。

1.4.2 制 粒

绵白糖有矫味功能,可改善乳酸菌带来的过酸的口感;绵白糖、麦芽糊精作填充剂时兼有黏合作用,利于制粒;碳酸钙作吸收剂,吸收油脂,美化产品外观且便于制粒。将发酵的m(豆粉)∶m(绵白糖)∶m(麦芽糊精)∶m(淀粉)∶m(碳酸钙)=2.0∶1.1∶0.8∶2.6∶0.8混合搅拌均匀后,用筛网制得颗粒,于电热恒温鼓风干燥箱中40 ℃烘干。

1.5 产品质量指标

1.5.1 感官指标

产品外部形态见图2,呈疏松的淡黄色颗粒状,色泽均匀一致,无结块;冲溶后呈均匀混悬液,有少量沉淀;酸甜适口,具有大豆特有香味,无异味;无正常视力可见外来杂质。乳酸菌豆粉颗粒冲剂制成后,乳酸菌在高糖、高酸和低水分活度的环境下,生长被抑制,在不加防腐剂的情况下,对产品的贮存性基本无影响。密封后存放3个月,无变质发潮。

图2 乳酸菌豆粉颗粒冲剂

1.5.2 理化指标

理化指标:水分质量分数≤4%,溶解度≥97%;重金属指标:砷质量分数≤0.5 mg/kg,铅质量分数≤1 mg/kg,铜质量分数≤10 mg/kg。理化指标依照文献[17]的相关规定执行。

1.5.3 微生物指标

乳酸菌数(出厂时)每g>108个;大肠菌群数每100 g<90个;致病菌不得检出。微生物指标依照文献[17]的相关规定执行。

2 结果与分析

2.1 绵白糖、麦芽糊精与淀粉对颗粒冲剂的影响

颗粒剂常用辅料有绵白糖、淀粉和麦芽糊精,其用量直接关系到制粒效果与成品的口感。若淀粉过少,则制粒时软材太干而黏性不足,通过筛网后呈疏松的粉粒或细粉太多;反之,制粒时软材形成团块不易压过筛网,且易返砂。调整绵白糖、麦芽糊精和淀粉的比例,按照不同的添加量,设定5个组,分别为A,B,C,D,E,见表1,并对颗粒剂制作过程中的软材黏合度、细粉量和颗粒长度进行评价,评价结果见表2。

表1 绵白糖、麦芽糊精与淀粉添加量对颗粒剂的影响

表2 绵白糖、麦芽糊精与淀粉实验结果

由表2可知:研磨后的豆粉粉末细、质地疏松,黏性较差,若淀粉质量分数过高,则软材黏合度不够,难以制粒;而绵白糖除有矫味作用外,还有黏合作用,若质量分数过低,颗粒剂过酸,口感不好,若质量分数过高,盖住酸味,口感变腻,丧失了乳酸菌豆粉颗粒冲剂酸酸甜甜的口感;麦芽糊精可提高颗粒剂溶解性能,增强稠度,改善口感,但若添加过量,则软材黏合度大大增加,制粒难度加大,且制粒效果不好。经分析验证,当m(绵白糖)∶m(麦芽糊精)∶m(淀粉)=1.1∶0.8∶2.6时,乳酸菌豆粉颗粒冲剂最易制粒且口感最佳。

2.2 淀粉浆、CMS-Na与CMC-Na对制粒的影响

颗粒剂制备中常用淀粉浆、羧甲基淀粉钠(CMS-Na)作黏合剂,羧甲基纤维素钠(CMC-Na)作崩解剂[18],其他条件不变,以CMS-Na为黏合剂,CMC-Na为崩解剂,按照不同的添加量,设定4个组分别为F,G,H,I,见表3,并对乳酸菌豆粉颗粒冲剂感官和制粒效果进行评价,评分结果见表4。

表3 CMS-Na与CMC-Na对颗粒剂的影响

表4 CMS-Na与CMC-Na实验结果

由表4可知:使用CMS-Na作黏合剂,效果并不理想,使用其制作的乳酸菌豆粉颗粒剂崩解时间较长,易吸湿,难溶出,因而影响其溶解性和稳定性。若添加CMC-Na作崩解剂,效果仍然不理想。经观察发现:当m(绵白糖)∶m(麦芽糊精)∶m(淀粉)=1.1∶0.8∶2.6时,以水作湿润剂已能够很好充当黏合剂,制粒成功。此外,大豆中含有大量油脂,需添加吸收剂对油脂进行吸收,若不添加,成品颜色深浅不一,且颗粒易成粉末,不能够很好黏合。经过观察比较,对于制备乳酸菌豆粉颗粒冲剂,碳酸钙为最佳吸收剂,能够很好地解决大豆油脂造成的颗粒松散的问题。

2.3 辅料添加量对颗粒感官和制粒效果的影响

在其他基本配料不变的条件下,选择绵白糖、麦芽糊精、淀粉和碳酸钙作辅料,按照不同的添加量,设定4个组分别为J,K,L,M,见表5,并对乳酸菌豆粉颗粒冲剂感官和制粒效果进行评价,评分结果见表6。

表5 乳酸菌豆粉颗粒冲剂配方试验设计

表6 配方实验结果

由表6可知:当m(经乳酸菌发酵后烘干的豆粉)∶m(绵白糖)∶m(麦芽糊精)∶m(淀粉)∶m(碳酸钙)=2.0∶1.1∶0.8∶2.6∶0.8时,乳酸菌豆粉颗粒冲剂的产品感官和制粒效果最好。

2.4 测定乳酸菌豆粉颗粒冲剂中所含活菌数

发酵豆粉常温密封存放17个月后,再次制取乳酸菌豆粉颗粒冲剂。

以无菌操作称取1 g样品,置于装有9 mL生理盐水的15 mL无菌离心管内,使用振荡器反复振荡至混匀,制成体积比为1∶10的样品匀液。用100 μL移液器吸取上述样品匀液100 μL,沿管壁缓慢注于装有900 μL生理盐水的无菌EP管中(注意吸头尖端不要触及稀释液),使用振荡器反复振荡使其混合均匀,制成体积比为1∶100的样品匀液。另取100 μL移液器吸头,按上述操作顺序,制成10倍递增样品匀液。选择3个不同稀释度的样品匀液(体积比分别为1∶10,1∶100,1∶1 000),各取200 μL对号接种在不同稀释度编号的无菌琼脂平板上(每个编号设3个重复)。再用涂布器将菌液在平板上涂抹均匀,每个稀释度用1个涂布器,更换稀释度时需将涂布器灼烧灭菌,37 ℃培养40 h。

取3个10-1稀释度的琼脂平板,见图3,计数得平板上菌落数分别为59,62,62个。则该稀释度3次重复的平均菌落数为61个。发酵豆粉经常温密封存放17个月,制取产品后乳酸菌活菌数仍有3 050 cfu/g。

图3 长出菌落的琼脂平板

研究表明:乳酸菌对体内重金属离子有吸附作用,能够促进营养物质的转化吸收,其活性代谢物有着抑菌作用,能有效地抑制肠道内有害菌的的生长繁殖,还具有调节人体肠道内的菌群平衡、缓解乳糖不耐症和提高机体免疫力等功效[19]。

3 结 论

经乳酸菌发酵后低温烘干,制作乳酸菌豆粉颗粒冲剂的最佳处方配比为m(豆粉)∶m(绵白糖)∶m(麦芽糊精)∶m(淀粉)∶m(碳酸钙)=2.0∶1.1∶0.8∶2.6∶0.8,产品酸酸甜甜,口感良好,便于携带储存,具有原料大豆特有的色、香和味,是一种营养健康的乳酸菌豆粉颗粒冲剂,可用于工业化生产中。豆粉颗粒冲剂的各项指标符合国家食品生产标准,其含有大量的活性乳酸菌,可以增加人体肠道乳酸菌菌群,维持人体肠道菌群平衡,改善人体健康状况,为现代人群的养生提供了良好而便捷的途径。当前,肠道疾病问题越来越突出、老龄化日益加剧和人们健康意识越来越强,口感良好且对人体有益的新型乳酸菌豆粉颗粒冲剂市场前景广阔,该研究也为乳酸菌豆粉颗粒冲剂工业化生产提供了理论依据和参考。此外,作为一种新型的人体肠道益生菌膳食补充剂,需要进一步通过动物实验来验证其改善肠道健康的效果,以及确定能维持肠道菌群平衡的日摄入量。

本文得到了湖北医药学院大学生创新创业训练计划项目(S201910929014,X202010929001)的资助。