不同土壤调理剂对植烟土壤养分及细菌群落的影响

谢仕祺，林正全，陈玉蓝，龙建林，陈树鸿，李红丽，张从良，王岩

(1.郑州大学生态与环境学院，河南 郑州 450001；2.四川省烟草公司凉山州公司宁南分公司，凉山 宁南 615600；3. 四川省烟草公司凉山州公司，四川 西昌 615000；4. 四川省烟草公司凉山州公司会理分公司，凉山 会理 615100)

土壤是烤烟养分的主要来源，良好的土壤状况是生产优质烤烟的基础。长期以来，部分烟农仅注重用地而忽略了养地，致使烟区土壤营养失调、土壤酸化、土壤板结等一系列问题产生[1-2]，烟区各种病虫害加重，烟叶产量和品质降低[3]，土壤微生物原生态环境恶化[4]，严重影响中国烟草的可持续发展。如何通过人为措施改良植烟土壤，提高烟株生长发育和烟叶产量已成为当今的研究热点。目前，在改变烟株光照环境及其种植密度[5]、改良栽培模式[6]、完善施肥管理等[7]方面做了大量的研究，而关于施用土壤调理剂改良凉山州植烟土壤、提升烤烟质量的研究报道很少。凉山州属亚热带季风气候区，是中国最适宜烟叶生产的地区之一，烤烟年产量占四川省年产量的70%，土壤pH值整体表现适中偏酸性[8]。已有研究表明，种植绿肥、增施有机肥及合理轮作等方式，均能改良植烟土壤[9]。而土壤调理剂可以有效调节植烟土壤理化性质、改善土壤微生物群落结构组成、促进植株生长与发育[10]，是土壤改良的新方法。土壤调理剂主要包括石灰类、矿物及工业废弃物、微生物肥料、有机物料以及生物质炭等[11]。石灰是酸化土壤改良剂，可以短时间内迅速提高土壤pH值并取得一定的增产效果，但如果长期施用有可能导致土壤“复酸化”[12]。高炭基调理剂可以增加土壤有机碳含量，协调土壤养分循环，促进植物生长[13]。高钙高镁土壤调理剂利于改良酸化土壤，平衡作物营养，提高作物的产量和品质[14]。因此，针对凉山州烟田的偏酸性土壤环境，研究2种调理剂对土壤养分含量及酶活性、细菌Alpha多样性、细菌群落组成和结构、烟株农艺性状及烤烟经济形状等方面的影响及其相关性，进一步明确高炭基调理剂和高钙高镁调理剂在凉山州德昌烟田土壤上的应用效果，从而筛选出适合改良德昌烟田的土壤调理剂。

1 材料与方法

1.1 试验地点

试验地点位于四川省凉山彝族自治州德昌县团山烟田，东经102°20′，北纬27°12′，海拔为1 487 m，年平均气温为17.7 ℃，降雨量为1 049 mm。植烟品种为云烟87，土壤质地为沙壤土，pH值为5.25，全氮含量为0.78 g·kg-1，碱解氮含量为87.15 mg·kg-1，速效钾含量为250.12 mg·kg-1，有效磷含量为56.85 mg·kg-1，有机质含量为17.73 g·kg-1。

1.2 田间试验

试验设置3个处理：常规施肥(CK)；常规施肥增施高炭基土壤调理剂(T1)，成分为生物质炭；常规施肥增施高钙高镁土壤调理剂(T2)，成分按质量比例为m(CaO)∶m(MgO)∶m(有机肥)=1∶1∶3。每处理设3组重复，随机排列，小区面积666.7 m2。具体施肥方法如下，CK：移栽前施用750 kg·hm-2腐熟羊粪有机肥和675 kg·hm-2复合肥，m(N)∶m(P)∶m(K)=1∶1∶3.5，起垄后及时覆盖塑料膜；T1：在CK基础上增施高炭基土壤调理剂，120 kg·hm-2；T2：在CK基础上增施高钙高镁土壤调理剂，120 kg·hm-2。田间农事操作按当地烟叶生产技术规范进行。成熟期测定烟株的农艺性状，烤后记录经济性状。

1.3 样品采集、测定项目及方法

1.3.1 样品采集 试验土壤在德昌烟田烟株成熟期采集，采集时间为2019年8月。每个处理采用S型5点取样法取3个平行样，去除烟株根际表层浮土后，在5～20 cm耕层对新鲜土壤进行样品采集。除去根、茎等杂质，过2 mm筛网后，均匀取部分样品装入10 mL离心管，-20 ℃保存，送至上海美吉生物医药科技有限公司进行高通量测序。部分土壤风干过筛后进行土壤理化性质和酶活性测定。

1.3.2 细菌多样性分析测定 由上海美吉生物医药科技有限公司对烟田土壤微生物进行16 S多样性测序，DNA提取和PCR扩增，根据E.Z.N.A.®soil试剂盒(OmegaBio-tek,Norcross,GA,U.S.)说明书进行总DNA提取，利用NanoDrop 2000对DNA浓度和纯度进行检测，利用1%琼脂糖凝胶泳检测DNA提取质量；细菌16 S用338 F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806 R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)引物对V3-V4可变区进行PCR扩增。

Illumina Miseq测序,使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物,利用Axy Prep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences,Union City,CA,USA)进行纯化，Tris-HCl洗脱，2%琼脂糖电泳检测。利用QuantiFluorTM-ST(Promega,USA)进行检测定量。根据Illumina MiSeq平台(Illumina,SanDiego,USA)标准操作规程将纯化后的扩增片段构建文库，16 S为PE2×300文库。用Illumina公司的MiseqPE 300平台进行测序(上海美吉生物医药科技有限公司)[15]。原始数据上传至NCBI数据库，序列号为PRJNA 688610。

1.3.3 烟株农艺性状、经济性状 参照YC/T 142—2010标准对烟株成熟期的农艺性状进行测定，其中包括株高、有效叶数、茎围、腰叶长及腰叶宽；参照GB 2635—1992烤烟标准对烟叶进行分级，并按照“中国烟草总公司关于2018年烟叶收购价格政策的通知”中的“2018年烤烟价区表”和“2018年烤烟收购价格表”计算经济性状，其中包括产量、产值、均价、上等烟和上中等烟比例。

1.3.4 土壤养分含量和酶活测定方法 参照鲍士旦[16]的方法对土壤养分含量进行测定，pH值采用电位法测定；碱解氮采用碱解扩散法测定；速效钾采用乙酸铵提取-原子吸收法测定；有机质采用重铬酸钾-油浴法测定；有效磷采用碳酸氢钠提取-钼锑抗比色法测定。参照李振高等[17]的方法对土壤酶活性进行测定，过氧化氢酶活性测定采用滴定法；蔗糖酶的测定采用 3,5-二硝基水杨酸比色法。

1.4 数据处理

试验测定数据均以3个数值的“平均值±标准差”表示，采用Excel 2016软件进行统计分析；利用 IBM SPSS 21软件进行独立样本t检验，P<0.05为显著性差异水平；土壤细菌群落的主成分分析和冗余分析采用R语言进行绘图分析。

2 结果与分析

2.1 2种土壤调理剂对烟株土壤养分含量和酶活性的影响

对德昌烟田成熟期土壤进行养分含量及酶活性测定，结果如表1所示。处理T1，T2与对照CK的理化性质存在差异。其中CK的pH值为4.66，土壤酸化比较严重，处理T1，T2较CK分别增加了0.56，0.51。与对照CK相比，处理T1，T2土壤有效磷含量分别提高8.69%，13.00%；土壤碱解氮含量分别提高9.48%，2.9%；土壤有机质的含量分别提高14.26%，10.89%；土壤速效钾含量分别提高28.75%，20.78%；交换性钙含量分别提高13.24%，60.74%；交换性镁含量分别提高41.82%，78.80%；过氧化氢酶活性分别提高了13.55%，27.41%；蔗糖酶活性分别提高了50.02%，26.23%。表明施用土壤调理剂能提高土壤养分含量和酶活性。

表1 成熟期烟田土壤养分含量和酶活性变化

2.2 2种土壤调理剂对烟株土壤细菌群落的影响

2.2.1 2种土壤调理剂对土壤细菌群落Alpha多样性的影响 表2中Coverage指数均≥0.98，说明取样合理，测序结果真实。对于烟株土壤细菌群落，施用高炭基调理剂(T1)和高钙高镁调理剂(T2)的Sobs指数均高于对照CK，而Shannon指数均低于CK。表明施用土壤调理剂提高了细菌群落的多样性，但降低了其均匀度。

表2 施用2种土壤调理剂后烟株土壤细菌Alpha多样性的差异Table 2 Differences of bacterial Alpha diversity in soil of tobacco plants after application of two soil conditioners

2.2.2 2种土壤调理剂对土壤细菌群落Beta多样性的影响 对成熟期凉山州德昌烟田土壤细菌群落进行主成分分析。如图1(A)所示，在门水平上第一和第二主成分分别可以解释26.17%和23.60%的原有变量。CK，T1，T2的相对距离较明显，相对独立，表明在门水平上对照与施用土壤调理剂的细菌群落结构存在差异。如图1(B)所示，在属水平上第一和第二主成分分别可以解释53.93% 和18.98%的原有变量。CK，T1，T2均相对独立，相距较远，表明在属水平上对照与施用2种土壤调理剂的细菌群落结构均存在差异。

图1 土壤细菌群落结构在门水平(A)和属水平(B)的主成分分析Fig.1 Principal component analysis of soil bacterial community structure at phylum level (A) and genus level (B)

2.2.3 2种土壤调理剂对土壤细菌群落组成结构的影响 对凉山州德昌烟田土壤细菌进行群落组成分析，在门水平上土壤细菌群落共检测出31类，其中CK，T1，T2烟田均为26类；在属水平上土壤细菌群落共检测出727类，其中CK烟田共528类，T1烟田共605类，T2烟田共652类。如图2(A)所示，群落中变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、Patescibacteria、绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteria)的平均相对丰度均超过5%，为烟田土壤细菌的主要菌门。WPS-2在CK中的相对丰度为5.51%，为对照的优势菌门；拟杆菌门(Bacteroidetes)在T1，T2中的相对丰度分别为7.60%，6.34%，为施用土壤调理剂处理中的优势菌门。

如图2(B)所示，烟田土壤中相对丰度>2%的细菌有Saccharimonadales，Chujaibacter，p_WPS-2，鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)。Saccharimonadales在CK，T1，T2烟田的平均相对丰度分别为58.45%，54.85%，58.96%，是烟田土壤细菌群落的主要菌属；Chujaibacter在T1，T2中的相对丰度分别为6.62%，7.01%，而在CK烟田的相对丰度为2.38%；norank_p_WPS-2在CK中的相对丰度为5.51%，高于其在T1的4.52%，T2的4.58%；鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)在CK中的相对丰度为2.21%，高于其在T1的2.01%，低于其在T2中的2.66%；值得注意的是Arachidicoccus仅在T1处理中出现，其相对丰度为2.97%。

图2 门水平(A)和属水平(B)上的土壤细菌群落组成Fig.2 Community composition of soil bacteria at phylum level (A) and genus level (B)

2.3 土壤环境因子与细菌群落的相关性

2.3.1 烟田土壤细菌群落结构与环境因子的RDA分析 为研究环境因子对烟田土壤细菌群落组成影响程度及其相关性，对细菌群落结构与环境因子进行了RDA分析(图3)，并对环境因子与细菌群落结构影响的显著性进行排序(表3)。如图3(A)所示。轴RDA1解释度70.29%，轴RDA2解释度15.65%，共解释85.94%的门水平上细菌群落变化，其中土壤速效钾含量与群落结构显著相关(P<0.05)，如图3(B)所示。轴RDA1解释度70.29%，轴RDA2解释度15.65%，共解释85.94%的属水平上细菌群落变化，其中土壤速效钾含量与群落结构显著相关(P<0.05)。

表3 RDA分析环境因子对细菌群落结构的影响显著性排序表Table 3 The ranking table of the significant influence of environmental factors on bacterial community structure by RDA analysis

OM:有机质；AN:碱解氮；AP:有效磷；AK:速效钾；ECa:交换态钙；EMg:交换态镁；Catalase:过氧化氢酶；Invertase:蔗糖酶。OM: organic matter; AN: alkali-hydrolysis nitrogen; AP: available phosphorus; AK: available potassium; ECa: exchangeable calcium; EMg: exchangeable magnesium; Catalase: Catalase；Invertase: Invertase.

2.3.2 烟田土壤细菌群落组成与环境因子的Spearman相关性分析 在烟田土壤细菌群落门水平和属水平上，将相对丰度前10的细菌与环境因子进行Spearman相关性分析。如表4所示，在门水平上共有6种菌门与养分含量和酶活性显著相关。其中厚壁菌门(Firmicutes)与土壤蔗糖酶呈显著正相关；绿弯菌门(Chloroflexi)与土壤交换性钙显著负相关，芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)则显著正相关；绿弯菌门(Chloroflexi)与土壤交换性镁显著负相关；放线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)与土壤有效磷显著负相关；厚壁菌门(Firmicutes)与土壤碱解氮显著正相关；装甲菌门(Armatimonadetes)与土壤有机质显著正相关；放线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)与土壤有效磷显著负相关；酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)与土壤速效钾含量显著负相关。

表4 烟田土壤细菌群落结构在门水平上与养分含量的Spearman相关性Table 4 Spearman correlation between the bacterial community structure of soil and nutrient content in tobacco field at phylum level

如表5所示，在属水平上共有7种菌属与养分含量有显著相关性。其中JG30-KF-AS9、酸杆菌目(Acidobacteriales)、B12-WMSP1与土壤交换性钙显著负相关，Saccharimonadaceae则显著正相关；Chujaibacter与土壤交换性镁显著正相关，酸杆菌目(Acidobacteriales)则显著负相关；酸杆菌目(Acidobacteriales)、AD3与土壤有效磷显著负相关；Acidibacter、AD3、酸杆菌目(Acidobacteriales)与土壤速效钾显著负相关。

表5 烟田土壤细菌群落结构在属水平上与养分含量的Spearman相关性Table 5 Spearman correlation between the bacterial community structure of soil and nutrient content in tobacco field at genus level

2.4 土壤调理剂对烟株农艺性状及经济性状的影响

2.4.1 2种土壤调理剂对烟株农艺性状的影响 对试验田成熟期的烟株进行农艺性状调查如表6所示。处理T1，T2与对照CK的腰叶长、宽和株高存在显著差异。T1，T2处理的农艺性状均优于对照CK，T2的最优。表明土壤调理剂促进了烤烟的生长，其中高钙高镁土壤调理剂效果更佳。

表6 施用2种土壤调理剂对成熟期烟株的农艺性状的影响Table 6 Effects of applying two soil conditioners on agronomic characteristics of tobacco plants at maturity stage

2.4.2 2种土壤调理剂对烤烟经济性状的影响 对试验田烤后烟的经济性状进行调查如表7所示。处理T1和T2产量、产值、均价上等烟和上中等烟比例均高于对照CK，T1，T2均价都超过20元·kg-1，T2上中等烟比例超80%。T1，T2较CK产量分别增加17.73%，22.10%；产值分别增加26.20%，41.69%。表明土壤调理剂提高了烟株的经济价值，高钙高镁土壤调理剂增加较多。

表7 施用2种土壤调理剂对烤后烟叶经济性状的影响Table 7 Effects of applying two soil conditioners on economic properties of roasted tobacco leaves

3 结论与讨论

研究结果表明，2种土壤调理剂均能改善烟田土壤的酸性，提高土壤的有效养分含量和酶活性。这与何秀峰等[18]，靳辉勇等[19]的部分结果一致。高炭基土壤调理剂能显著提高烟田土壤有机质、碱解氮、有效磷、速效钾等的含量和蔗糖酶的活性。原因可能在于：一是由于高炭基调理剂具有独特的多孔隙结构和丰富的表面含氧极性官能团，可以有效减少磷和钾在土壤中的流失[20]；二是施用高炭基调理剂能够有效抑制土壤微生物的反硝化作用，从而可以降低氮素损失[21]；三是施入高炭基调理剂后，土壤有机质的含量增加，既为微生物生命活动提供了能源物质，也为酶促反应提供了丰度的底物，从而提高了蔗糖酶的活性[18]。而高钙高镁土壤调理剂能显著提高土壤交换态钙镁的含量和蔗糖酶的活性。这与周杰文等[14]的研究结果一致。

PHILIPPOT等[22]研究表明，烟田土壤理化性质和微生物活性易受调理剂的影响，土壤微生物群落组成和结构发生变化，从而改变了微生物区系[23]。本研究中，施用高炭基和高钙高镁调理剂提高了细菌群落的多样性，但同时也降低了其均匀度。这可能是土壤调理剂抑制某些细菌造成的。土壤细菌群落结构与环境因子RDA分析表明，速效钾含量是引起土壤细菌群落变异的主导性因子，这与烤烟是喜“钾”[7]作物相符合；在属水平上，过氧化氢酶和蔗糖酶的活性与细菌群落结构有较大相关性。ROESCH等[25]研究发现，变形菌门(Proteobacteria)为农田土壤细菌群落的主导性门，本研究所有处理中的变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度均超过25%，远高于其他菌门的相对丰度。属水平上细菌群落组成分析表明，施用2种土壤调理剂均增加了Saccharimonadales的相对丰度，Saccharimonadales与交换性钙呈显著正相关，与交换性镁也有较大相关性，土壤中交换性钙、镁含量高，土壤质地较细，保肥能力相对较高。施用2种土壤调理剂均增加了Chujaibacter的相对丰度，Chujaibacter与过氧化氢酶活性有较大正相关性，且施用土壤调理剂提高了过氧化氢酶活性，Chujaibacter属于罗河杆菌科(Rhodanobacteraceae)，研究表明，罗河杆菌科对根腐病病原菌具有一定的生防活性[27]。施用高钙高镁调理剂增加了鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)的相对丰度，鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)是土壤主要有益菌之一，能够降解高分子有机污染物，抵抗多种病原菌，促进烟株根际吸收营养，在维持土壤氮平衡方面起着重要作用[28]。Arachidicoccus仅在施用高炭基的处理中出现，已有研究表明，Arachidicoccus通过溶解土壤中的磷合成植物生长素，对植物有明显促生作用，可显著提高植物组织中的碳氮磷含量[29]。

2种土壤调理剂均能提高德昌烟田土壤的pH值和土壤细菌群落多样性，细菌群落结构较为丰富，有机质、有效磷、碱解氮、速效钾、交换性钙、镁的含量增加，蔗糖酶、过氧化氢酶活性提高，显著促进烟株的生长发育，提高了烟叶产量、增加烟农经济效益，且高钙高镁土壤调理剂效果更佳。