不同促腐菌剂对园林废弃物堆肥理化性质和优势微生物群落的影响

夏金利， 王岩， 董春玲， 刘海宁， 唐航， 尚韬， 芦阿虔

(郑州大学生态与环境学院，河南 郑州 450000)

随着中国经济的快速发展，人们对城市生态环境的要求越来越高。伴随着城市绿地面积大幅度地增加，园林废弃物的产生量骤增。资料表明，中国每年产生的园林废弃物总量超过4 000万t，已成为城市固废中除污泥外的又一大污染源[1]。因此，如何合理处置园林废弃物以减少对环境的危害就显得尤为重要。

为探索适宜的园林废弃物处理方式，人们已相继开展了较多研究。国内外园林废弃物处理的实践表明，高温好氧堆肥是目前应用最多的园林废弃物资源化利用方法之一[2-5]。高温好氧堆肥是在合适的条件下利用多种微生物将固体有机物进行分解并逐步转化为稳定腐殖质的复杂生物化学过程[6]。但是，由于园林废弃物富含纤维素、半纤维素和木质素等难降解的物质，所以在园林废弃物堆肥过程中仍存在降解速度慢和堆肥品质难以保证等问题。近年来，研究人员试图通过添加微生物菌剂或辅助材料以提高其发酵速度、定向转化和降解某些特定成分等来改善这种状况。ZHANG等[7]研究表明，在园林废弃物中添加白腐真菌可提高堆体温度、加快有机物分解，并且高温后再接种更有利于有机物的降解。付冰妍等[8]研究表明在园林废弃物中添加芽孢杆菌B01可提高木质素和纤维素的降解率以及腐殖酸的含量。李燕等[9]研究表明在园林废弃物中添加腐熟产品、牛粪、变色栓菌和复合菌剂均可促进微生物增殖并加速堆肥进程。以上研究均证，实添加微生物菌剂可以有效地促进固体废弃物堆肥腐熟，并且由于堆肥本质是依靠堆体中微生物降解有机物，所以进一步探究堆肥过程中微生物群落变化尤为重要。如HU等[10]研究表明，在以猪粪和菇渣进行共堆肥时添加木质纤维素降解菌可以有效地影响真菌群落分布、增加群落多样性和抑制病原菌；李昌宁等[11]研究表明，添加以Acinetobacterpittii、Bacillussubtilissubsp.Stercoris和Bacillusaltitudinis按照体积比为2∶1∶1复合而成的微生物菌剂可以显著提高并维持堆肥过程中的优势门、属细菌群落丰度，进而促进堆体升温加速堆肥腐熟。目前,较多学者专注于研究畜禽粪便堆肥中微生物群落演替，但是鲜有人探究园林废弃物堆肥过程中微生物群落的演替规律；而且实践中简单地或无针对性地添加单一或几种微生物复配菌株不仅实现提高堆肥效果的目的而且处理成本较高，所以如何节约处理成本也变得尤为重要。

因此，本研究针对园林废弃物成分和特点，选择已腐熟的园林废弃物堆肥(简称堆肥返料)、富含降解纤维素及木质真菌的香菇菌渣(简称菇渣)和市售发酵菌剂(简称市售菌剂)作为发酵菌剂，以不添加任何菌剂处理作为对照，分析了添加不同微生物菌剂对园林废弃物堆肥效果的影响，并通过高通量测序技术考察了堆肥过程中微生物群落结构和多样性等变化，旨在为提高园林废弃物堆肥发酵速度和改善堆肥品质提供技术支持。

1 材料和方法

1.1 堆肥原料

研究所用园林废弃物为郑州市某居民小区栾树和女贞等树木修剪枝，修剪枝经粉碎机一次性粉碎成3～5 mm左右的细碎颗粒，其基本理化性质如表1所示。

表1 堆肥原料的理化性质Table 1 Basic physicochemical properties of the composting raw materials

1.2 试验设计

试验共设计4个处理，3次重复：CK(对照):150 kg修剪枝+1.5 kg尿素; T1:150.0 kg修剪枝+1.5 kg尿素+10.0 kg堆肥返料;T2:150.0 kg修剪枝+1.5 kg尿素+10.0 kg菇渣; T3:150.0 kg修剪枝+1.5 kg尿素+1.0 kg市售菌剂。

堆肥返料为2018年春季园林废弃物堆肥腐熟产品(150.0 kg修剪枝+3.0 kg尿素+1.0 kg市售菌剂)。菇渣为苹果修剪枝栽培香菇后的废弃基质。市售腐熟菌剂为某生物技术公司产品，主要由枯草芽孢杆菌和酵母菌构成，有效活菌数(cfu)≥10亿·g-1，主要用于有机物料好氧堆肥发酵。

2018-10-25进行备料、处理和堆制，各处理均堆置成高约1.0～1.2 m的自然圆锥体，试验自2018-10-26至2018-11-24共30 d在居民小区进行，为防止淋雨，堆体覆盖塑料薄膜。

1.3 样品采集

试验的第1周每3 d翻堆1次，以后每7 d翻堆1次，并于第3、6、10、30 天采用五点取样法采取各处理混合样，装袋并编号后带回实验室。其中一部分自然风干并用粉碎机粉碎后过20目筛，以备理化性质的测定；另一部分冷冻至-20℃下用于高通量测序分析微生物多样性。

1.4 测定项目及方法

1.4.1 堆肥理化性状的测定 堆体温度采用五点测温法：选取堆体四周及中心共5个点，测定深度大约在堆体下30 cm处，使用8400电子探针温度计于每日12：00对堆体进行测定，取平均值作为当日堆体温度并记录堆肥场地小气候的气温。

堆肥样品中全氮、全磷和全钾等测定方法参考有机肥标准(NY 525—2012)进行；纤维素、半纤维素和木质素的测定参考系统定量分析程序[12]。

种子发芽指数(GI)的测定：按V(水，30 mL)：m(物料，3 g)=10∶1混合样品，然后以160 r·min-1振荡浸提1 h，于铺有滤纸的培养皿中放入滤液5 mL和小麦芽苗菜种子20颗，在25 ℃避光环境培养48 h，根据平均根长及种子发芽率进行计算[13]，每个样做3组平行。

1.4.2 高通量测序 根据E.Z.N.A.®soil试剂盒(Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)说明书进行总DNA抽提，DNA浓度和纯度利用NanoDrop2000进行检测，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量；通过PCR扩增细菌和真菌总DNA-ITS序列，细菌所用引物为338F (5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R (5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)，真菌所用引物为SSU0817F(5’-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3’)和1196R(5’-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3’)。扩增程序为：95 ℃预变性3 min，27个循环(95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s)，最后72 ℃延伸10 min ,最终维持在10 ℃直至停止，PCR扩增产物用2%琼脂糖电泳检测取3 μL，最终产物利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序。

1.5 数据处理及分析

采用SPSS20.0对数据进行显著性分析，Origin2017软件进行数据整理并作图。微生物PCA分析、群落柱状图和Spearman相关性分析作图均由上海美吉生物医药科技有限公司提供的I-Sanger生信信息分析平台完成[14]。

2 结果与分析

2.1 堆肥过程中堆肥温度和种子发芽指数的变化

温度是堆肥过程中最重要的指标之一，它不仅反映了微生物的活性，而且可以了解堆肥所处不同阶段[15]。在堆肥过程中微生物通过分解有机物释放热量使堆体升温，高温期停留的时间越长越有利于消灭有害病原菌[5]。由图1a可以看出，T1、T2、T3和CK处理的高温期(50 ℃以上)时间分别为9、10、8和7 d。有研究表明，添加普通微生物菌剂可以加速堆体升温[5]，但本试验添加堆肥返料、菇渣使堆体在第1天分别快速升温至47.4 ℃、46.3 ℃，比对照(CK)高温期(>50 ℃)也分别延长了2 d和3 d，这主要是由于堆肥返料和菇渣中均富含有大量分解纤维素和木质素的微生物所致。

种子发芽指数(GI)可作为表现堆肥毒性的生物指标，他是评价堆肥腐熟度的一个重要参数，可直观表现堆肥的进程及毒性强弱。成熟堆肥有机酸大量减少，毒性降低，发芽率提高[16]。在堆肥过程中(图1b)各处理GI整体呈上升趋势，当堆肥结束时各个处理的GI值均达到80%以上，表明堆肥已完全腐熟。

图1 堆肥过程中温度(a)和发芽指数(b)的变化Fig.1 Changes of temperature (a) and germination index (b) during the composting process

2.2 不同促腐菌剂对堆肥肥料指标的影响

表2 堆肥期间全氮、全磷和全钾含量变化

2.3 不同促腐菌剂对堆肥中纤维素、半纤维素和木质素含量的影响

园林废弃物堆肥速度慢的原因主要是木质纤维素等含量高，所以探究堆肥过程中其含量的变化可以有效地反应堆体腐熟度。如表3所示，在堆肥第3天纤维素含量在T1、T2、T3和CK中分别为324.3、237.3、300.0和285.6 g·kg-1(P<0.05)，当堆肥进行至第30天时在各处理中其含量降至184.0、174.1、205.6和223.2 g·kg-1(P<0.05)，即各处理的纤维素降解率分别为43.3%、27.0%、31.4%和21.8%。这表明添加堆肥返料、菇渣和市购菌剂均加速了材料中纤维素降解，但以添加堆肥返料的处理效果最佳。半纤维素含量在整个堆肥过程中也是逐渐下降的，堆肥结束时CK中半纤维素降解率为13.4%，T1、T2和T3的降解率分别为28.9%、6.3%和15.4%。本试验中木质素含量同样呈下降趋势，但整体降幅较小。当堆肥结束时，T1、T2、T3和CK的木质素降解率分别为25.7%、17.6%、20.9%和15.1%。

表3 堆肥过程中木质纤维素等含量变化

2.4 不同促腐菌剂对堆肥过程中微生物Beta多样性分析

为探究添加不同促腐菌剂对堆肥过程中微生物群落的影响，对堆肥样本进行了PCA分析。由图2a看出，随着堆肥进行各处理间细菌分散程度逐渐增强，T1、T2、T3距CK的距离为T2>T1>T3。在堆肥进行至第3天时(图2b)T1、T2、T3和CK中真菌群落差异明显，随着堆肥进行差异逐渐减小，10 d以后所有样本真菌群落几乎无差异。这表明添加堆肥返料或菇渣在堆肥初期改变了堆体内细菌群落结构并随着堆肥的进行其优势逐渐增强；而添加堆肥返料、菇渣或市售菌剂仅在堆肥初期影响了堆体中真菌群落结构。

图2 不同处理堆肥过程中第3、6、10和30天微生物群落(PCA)分析((a)指在细菌属水平，(b)指真菌属水平)Fig.2 Analysis of microbial community diversity (PCA) on the 3rd, 6th, 10th and 30th day of the composting process with different treatments((a) refers to the level of bacteria and (b) refers to the level of fungi)

2.5 不同促腐菌剂对堆肥过程中细菌群落组成的影响

在整个堆肥过程中，Proteobacteria(29%～67%)、Bacteroidetes(14%～34%)、Actinobacteria(11%～44%)和Firmicutes(1%～10%)作为优势门存在于各处理中[20-21]，随着堆肥进行它们的相对丰度也随着发生改变(图3a)，而Chloroflexi在堆肥第3天被检测仅存在于T1和T2中，随着堆肥进行被检测其存在于各个处理中。Proteobacteria作为主要门与C、N代谢有关，可加速堆肥过程中有机物的降解[22-23]，在整个堆肥过程中其在T1、T2和CK中相对丰度变化规律为先下降后升高结束时其相对丰度均低于堆肥第3天的相对丰度；而在T2中的相对丰度均呈逐渐下降趋势。Bacteroidetes在降解木质纤维素扮演重要角色[24]，它的相对丰度越高越有利于堆肥的腐熟。在堆肥第3天时T1(27.9%)、T2(20.9%)和T3(16.7%)处理的相对丰度均高于CK(14.3%)，但当堆肥进行至第30天时T1(17.9%)和T2(17.9%)的相对丰度却低于T3(30.5%)和CK(25.8%)，这可能是T1和T2中可降解木质纤维素含量快速下降有关。Actinobacteria可以有效地降解纤维素和木质素，是堆肥过程中成熟阶段的优势菌门也是堆肥成熟的指标之一[25]。在整个堆肥进程中CK(11.0%～13.6%)处理的相对丰度变化幅度较小，在T1(14.6%～22.8%)、T2(22.4%～42.6%)和T3(15.7%～44.1%)的相对丰度变化幅度较大，说明添加促腐菌剂促进了其大量繁殖，从而加速了园林废弃物堆肥的速度。

图3 细菌在门水平(a)和属水平(b)的群落组成

在属水平，随着堆肥进行堆体中除norank_f_Cylobacteriaceae、Thermobifida和Myroides未存在于堆肥的全过程外，其他菌属均存在整个堆肥阶段，其差异在于在不同阶段的相对丰度不同导致不同堆肥阶段的优势菌也不同。如图3b所示,在第3天Sphingobacterium在4个处理中的相对丰度差异已显著，在T1(17.4%)、T2(8.1%)中的相对丰度远高于T3(1.2%)和CK(1.7%)；随着堆肥进行在各处理中其相对丰度先增加而后有所降低，当堆肥进行至第30天，T3(21.3%)、CK(9.7%)的相对丰度大于T1(3.0%)、T2(4.1%)。Sphingobacterium可以产生木质纤维素降解酶[26]，在堆肥初始它的相对丰度越高越利于堆体腐熟，当堆肥结束时它在T3和CK的相对丰度高于T1和T2，这进一步表明添加堆肥返料和菇渣作为促腐菌剂可以加速堆肥进程，而添加市售菌剂效果不显著。

在堆肥第3天时Thermobifida仅在T2(0.3%)中被检测出，堆肥进行至第6天时Thermobifida同时出现在T1(0.3%)、T2(4%)和CK(0.2%)处理中。当堆肥进行至第30天时，T2中Thermobifida的相对丰度升至13.9%，在其他处理未被检测出。Thermobifida通常存在于腐烂的有机物中，可以分泌多种纤维素分解酶[27]，添加菇渣的T2加速了Thermobifida菌群繁殖，有利于园林废弃物的堆肥发酵。Cellulosimicrobium是一种革兰氏阳性菌，可以降解半纤维素[28]，在堆肥第6天其作为优势菌属存在于在T2(5.1%)中，在其他3个处理中其相对丰度低于1%。4个处理中Cellulosimicrobium和Thermobifida的相对丰度均以T2最高，说明添加菇渣更有利于园林废弃物的快速降解。Enterobacter作为致病菌，如果不妥善处理会引起人体的一系列疾病[29]。堆肥第3天时CK处理中该菌所占比例为18%，T1、T2和T3处理所占比例分别仅为5.2%，7.2%和7.5%，显然堆肥时添加菌剂在一定程度上抑制了Enterobacter的繁殖，随着堆肥进程的推进此菌再未被检测到。Myroides作为致病菌，对大多数的抗生素具有抵抗能力[30]。堆肥第3天它仅存在于T1(0.5%)、T3(6.8%)和CK(2.6%)中，当堆肥进行到第30天时在各处理中均未被检测到。因此，添加堆肥返料和菇渣作为菌剂不仅可以增加有益细菌的相对丰度促进木质纤维素的降解加速堆体腐熟，并能抑制一些病原体以提高堆肥产品的安全性。

2.6 不同促腐菌剂对堆肥过程中真菌群落组成的影响

在门水平，Ascomycota、Basidiomycota作为优势菌门存在于整个堆肥过程中(图4a)，随着堆肥进行它们的相对丰度也随着发生变化。Ascomycota广泛存在[31]并且可以降解木质纤维素[32]。在第3天时Ascomycota在T1、T2、T3和CK中的相对丰度分别为89%、88%、91%和92%；第6天时在CK中相对丰度下降至25%，而分别在T1、T2和T3中的相对丰度为80%、86%和90%；第10天时在T2中其相对丰度达到了99%，在T1、T3和CK中的相对丰度分别为95%、77%和45%；第30天时在T2其相对丰度仍然高达99%，在CK处理中其相对丰度回升至72%，在T1和T3中的相对丰度为98%和94%。这一结果表明，相对于CK添加促腐菌剂可使堆体中Ascomycota的相对丰度在整个堆肥过程中均维持较高水平。在降解木质纤维素时Basidiomycota扮演着重要角色，其相对丰度越高越利于有机物的降解。在第3天其在T1(9%)、T2(9%)和T3(8%)的相对丰度高于CK(7%)；第6天，其在T1和CK中的相对丰度分别为4.5%和2.0%，但未在T2和T3中检测到；第30天时其在T1和T3中的相对丰度分别为2.05%和2.3%，在T2中仍未检测到，CK为10.3%，说明堆肥返料具有较好的促腐作用。

在属水平上，随着堆肥进行各个处理中存在的真菌种类发生变化并且逐渐减少，如图4b所示。Pseudallescheria在降解木质纤维素的过程中扮演重要角色[10]，在第3天时其在各个处理中的相对丰度分别为12.6%、7.5%、8.9%和2.4%；在第6天时其在T1(13.7%)、T2(15.9%)、T3(26.3%)的相对丰度高于CK(2.7%)；在第10天和30天时，其在T1、T2、T3、CK的相对丰度分别为25.2%、7.0%、73.2%、38.4%和26.0%、17.5%、44.5%、28.1%。由此表明：添加堆肥返料或菇渣在堆肥前期提高了Pseudallescheria的相对丰度，而添加市售菌剂提高了整个时期堆体中Pseudallescheria的相对丰度。Fusarium是重要的植物病原菌之一，可侵染多种植物引起病害，对农业生产造成了严重的危害。在堆肥进行至第3天时，在T1(1.4%)和T2(1.9%)处理中其相对丰度小于CK(6.5%)，当堆肥进行至30天时其T1(0.2%)、T2(0.2%)、T3(0.3%)和CK(0.6%)的相对丰度均低于0.5%。这表明添加高温好氧堆肥可以实现堆肥产品无害化，堆肥返料或菇渣作为促腐菌剂在堆肥初期就具有较好的抑制有害病原菌繁殖生存的特质。

图4 真菌在门水平(a)和属水平(b)的群落组成

2.7 园林废弃物堆体微生物群落与环境因子的Spearman相关性分析

探究环境因子与微生物群落的关系，对于提高堆肥产品的质量和安全性具有重要意义。因此，将全氮、全磷、全钾、纤维素、半纤维素和木质素的含量作为环境因子与微生物群落进行Spearman相关性分析，结果如表4和表5所示。Thermobifida与全氮、全磷、全钾和GI呈正相关，但与纤维素、半纤维素和木质素呈负相关(P≤0.05)。Myroides与Thermobifida的规律相反，它与与全氮、全磷、全钾和GI呈负相关，与纤维素、半纤维素和木质素呈正相关(P≤0.05)。Cellulosimicrobium与纤维素和半纤维素呈负相关(P≤0.05)。由于Myroides作为一种致病菌与全氮、全磷、全钾和GI均呈负相关并随着堆肥进行至结束其相对丰度减少到检测不到，进一步表明堆肥可以促使园林废弃物实现无害化处理。Thermobifida可以降解纤维素并与堆体中的纤维素含量呈负相关；Cellulosimicrobium可以降解半纤维素并与半纤维素含量呈负相关，这为之后进一步研究高效促腐菌剂提供了思路。Pseudallescheria与GI呈显著正相关(0.001

表4 属水平上细菌群落与环境因子的Spearman相关性

表5 属水平上真菌群落与环境因子的Spearman相关性Table 5 Spearman correlation between fungal community and environmental factors at the genus level

Boeremia、Fusarium均与全钾和GI呈负相关(P≤0.05)。Pyxidiophora与全氮、全磷、全钾和GI呈正相关并结合其在堆肥结束时的相对丰度来看，它的存在可能促进堆肥进程。随着堆肥进行堆体中的全钾含量逐渐增加且堆体毒性逐渐减弱而Boeremia和Fusarium均为致病菌且均与全钾和GI呈负相关，至堆肥结束时Boeremia和Fusarium均未在堆体中检测到，再次验证了堆肥化处理园林废弃物是一种可推广的方法。

3 结论

1) 添加堆肥返料或菇渣可促使堆体快速升温并延长2 d和3 d的高温期时间。

2) 添加堆肥返料作为促腐菌剂使堆体纤维素、半纤维素和木质素等降解率相较于CK分别显著提高了21.5%、15.5%和22.3%；添加菇渣提高了纤维素和木质素的降解率仅分别为5.2%和2.5%；添加市售菌剂使堆体内纤维素、半纤维素和木质素降解率相较于CK分别提高了9.6%、2%和5.8%。

3) 以堆肥返料或菇渣作为促腐菌剂可以提高堆体内有益菌(Sphingobacterium、Cellulosimicrobium、Thermobifida和Pseudallescheria)的相对丰度，加速堆体内木质纤维素的降解，有效抑制堆体内有害菌(Enterobacter、Myroides和Fusarium)，实现了堆肥的无害化处理。

4)Spearman相关分析表明，在堆肥过程微生物群落结构的变化受环境因子的影响，其中Thermobifida和Cellulosimicrobium与纤维素和半纤维素含量呈负相关，为进一步开发高效促腐菌剂提供了思路；作为致病菌的Myroides、Boeremia和Fusarium均与GI呈正相关；Pyxidiophora与全氮、全磷、全钾和GI呈正相关，结合其在堆肥结束时在各个处理中的相对丰度，推测其加速堆肥进程的作用。