高效液相色谱法测定辽宁不同产地朝鲜淫羊藿油炙前后木兰花碱的含量

原明月，乔宇航，郭鑫，牛野，王静，贾天柱，袁子民（辽宁中医药大学，辽宁 大连 116600）

朝鲜淫羊藿为小檗科植物朝鲜淫羊藿Epimedium koreanumNakai的干燥叶，为2020年版《中国药典》一部淫羊藿多基原药材的来源之一[1]，主要分布于辽宁省东部、吉林省东部及黑龙江和吉林交界等地，市售的淫羊藿药材或饮片主要以朝鲜淫羊藿与淫羊藿（心叶）为主，柔毛与箭叶淫羊藿品种较少，朝鲜淫羊藿已成为辽宁省道地药材及市售淫羊藿药材的主要来源[2-3]。目前对淫羊藿油炙前后的含量测定主要以黄酮类成分报道较多，有关炙后对木兰花碱含量的影响研究尚未见报道，木兰花碱具有抗焦虑、降压、免疫调节、抗炎、抗氧化及抗真菌等药理活性[4-6]。因此，本研究主要对辽宁不同产地（凤城、宽甸、桓仁、新宾）朝鲜淫羊藿油炙前后木兰花碱的含量进行测定与分析，为辽产道地药材朝鲜淫羊藿生品、炙品质量标准制订、炮制机制的深入研究提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器

Agilent1100高效液相色谱仪（美国Agilent）；SG3300型超声波清洗器（上海冠特超声仪器有限公司）；电子分析天平（天津天马衡基仪器有限公司）。

1.2 试药

木兰花碱对照品（四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq20031310，含量＞98%），乙腈、磷酸为色谱纯，其他均为分析纯，水为娃哈哈纯净水。朝鲜淫羊藿药材于2020年6月采收于辽宁不同产地，经辽宁中医药大学药用植物教研室尹海波教授鉴定为小檗科植物朝鲜淫羊藿Epimedium koreanumNakai的干燥叶，按2020年版《中国药典》一部淫羊藿饮片项下炮制方法制成淫羊藿及炙淫羊藿。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：A相为乙腈，B相为0.1%磷酸，梯度洗脱（0～8 min，10%A；8～20 min，10%～15%A；20～40 min；15%～35%A；40～45 min，35%～80%A）；流速：1.0 mL·min－1；检测波长：226 nm；柱温：30℃；进样量：10 μL。在该色谱条件下，空白溶剂无干扰，淫羊藿、炙淫羊藿供试品中木兰花碱峰的理论板数分别为31 911、33 058，分离度均为1.83。色谱图见图1。

图1 对照品（A）、淫羊藿（B）、油炙淫羊藿（C）、空白溶剂（D）的HPLC色谱图Fig 1 HPLC chromatogram of reference substance（A），epimedii folium（B），epimedii folium prepared with oil frying（C），and blank solution（D）

2.2 对照品溶液

取木兰花碱对照品适量，精密称定，分别置于100 mL量瓶中，加50% 乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成含木兰花碱38.8 μg·mL－1的对照品溶液。

2.3 供试品溶液

分别称取淫羊藿、炙淫羊藿粉末（过三号筛）0.2 g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入25 mL 50%乙醇，称定重量，超声（功率250 W，频率30 kHz）处理30 min，放冷，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，即得。

2.4 线性关系考察

分别精密量取木兰花碱对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、10.0 mL分别置10 mL量瓶中，加50%乙醇至刻度，摇匀，即得不同质量浓度的系列对照品溶液。按照“2.1”项下色谱条件测定，以对照品质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程为Y＝43.01X＋6.821（r＝0.9998），表明木兰花碱在3.88～38.8 μg·mL－1与峰面积线性关系良好。

2.5 精密度试验

取同一炙淫羊藿供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下连续进样6次，记录峰面积，计算木兰花碱的RSD为0.44%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

取同一炙淫羊藿粉末（过三号筛），按“2.3”项下方法分别制备6份供试品溶液，测定木兰花碱的含量，其平均含量为3.28 mg·g－1，RSD为2.4%，表明该法重复性良好。

2.7 稳定性试验

取同一炙淫羊藿供试品溶液，按“2.1”项色谱条件，分别在0、2、4、6、8、10 h进样测定，记录峰面积，计算木兰花碱的RSD为2.1%，表明供试品溶液在10 h内稳定。

2.8 加样回收试验

分别取同一炙淫羊藿粉末（已知木兰花碱含量为0.328%）0.1 g各6份，精密称定，分别精密加入木兰花碱对照品溶液（38.8 μg·mL－1）8.0 mL，再精密加入50%乙醇17.0 mL，其余按“2.3”项下方法制备6份供试品溶液。按照“2.1”项下色谱条件操作，结果平均回收率为97.6%，RSD为1.2%，符合测定要求。

2.9 样品含量测定

分别取不同产地的淫羊藿、炙淫羊藿粉末，按“2.3”项下方法分别制备供试品溶液，在同一色谱条件下测定木兰花碱的含量，结果见表1。

表1 木兰花碱含量测定结果(n＝3)Tab 1 Content of magnoflorine (n＝3)

3 讨论

3.1 检测波长的筛选

将木兰花碱对照品溶液在200～400 nm进行扫描，发现木兰花碱在226、271、318 nm处均有吸收，但在226 nm处吸收最强，综合考虑分离度及溶剂影响，本文选择226 nm作为紫外检测波长。

3.2 流动相的筛选

对于淫羊藿中木兰花碱的含量测定的文献报道中多采用乙腈-0.5 mol·L－1KH2PO4溶液[7-9]或乙腈-0.1 mol·L－1磷酸二氢钠溶液[10-11]（14∶86）为流动相进行等度洗脱，但由于木兰花碱极性较大，供试品样品中还含有大量中等极性、极性小的成分，大量样本测定时采用等度洗脱易造成色谱柱污染。本研究对流动相筛选，最后采用配制方法简单的乙腈-0.1%磷酸为流动相[12]，梯度洗脱，能够使各色谱峰达到较好的分离，利于保护色谱柱，适合大批量样本测定。

3.3 小结

本文分别对淫羊藿、炙淫羊藿进行了木兰花碱含量测定，结果发现辽宁的4个产地中，丹东凤城东汤镇含量最高，本溪桓仁八里甸子镇含量最低；经羊脂油炮制后的炙淫羊藿中结果木兰花碱含量均比生品降低，这与文献报道中黄柏炮制后木兰花碱含量降低一致[13]，表明木兰花碱遇热可能不稳定，其降低原因尚需进一步研究。