超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法定性分析盐酸阿呋唑嗪中的杂质

王军，邱荣英，李铁健，张贵民*（1.山东新时代药业有限公司，山东 临沂 273400；2.国家手性制药工程技术研究中心，山东 临沂 273400；3.鲁南制药集团股份有限公司，山东 临沂 276005）

盐酸阿呋唑嗪，化学名为N-{3-[（4-氨基-6，7-二甲氧基-2-喹唑啉基）甲基氨基]丙基}-2-四氢呋喃甲酰胺盐酸盐，是一种喹唑啉衍生物，属α1肾上腺素能受体拮抗剂，其化学结构见图1。该药物能高选择性地与前列腺的α1-受体竞争性结合，影响α1受体介导的平滑肌收缩，减轻良性前列腺增生患者的排尿障碍[1]，有效改善尿频、尿急、排尿困难等临床症状[2]，对输尿管结石也有一定疗效[3]。该药物由赛诺菲-圣德拉堡公司研发，于1988年在法国首次上市，其缓释片剂于2003年在美国上市，2004年底在中国上市[4]。

图1 盐酸阿呋唑嗪结构式Fig 1 Structure of alfuzosin hydrochloride

目前国内外对盐酸阿呋唑嗪的研究主要集中在合成[1，4-7]、制剂[8-11]与药物动力学方面[12-16]，分析方法主要包括液相色谱法[10，14-15，17-19]与高效薄层色谱法[20]，利用高效液相色谱-质谱（LCMS/MS）法对其杂质研究未见报道。随着公众与媒体对药物安全性的日益关注，对药物中的杂质控制已成为药品质量控制的重要环节，开展杂质研究不仅能定性杂质，还能提示工艺改进。本文采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）法首次对盐酸阿呋唑嗪中的杂质进行了定性分析，为下一步工艺优化与质量研究提供依据。

1 仪器与试药

1290 Infinity Ⅱ型超高效液相色谱、G6540B四极杆-飞行时间质谱仪（美国Agilent公司），配有电喷雾离子源（ESI）以及MassHunter B.06.00数据处理系统。盐酸阿呋唑嗪（企业A）；乙腈（色谱纯，美国Merck公司）；乙酸铵（色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司）；实验用水为自制超纯水。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱Thermo Hypersil gold aq C18柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；流动相：A相为10 mmol·L－1乙酸铵水溶液，B相为乙腈；梯度洗脱（洗脱程序为：0～3 min，10%B；3～10 min，10%～95%B；10～11 min，95%～10%B；11～15 min，10%B）。柱温为40℃；波长为245 nm；流速为0.3 mL·min－1；进样量为 2 μL。

2.2 质谱条件

电喷雾离子源（ESI），正离子模式；扫描范围m/z50～800；雾化气温度：300℃；毛细管电压4 kV，干燥气流速10 L·min－1；裂解电压60 V；锥孔电压45 V；碰撞能量：30 eV。

2.3 供试品溶液的配制

称取盐酸阿呋唑嗪样品10.0 mg，置于10 mL量瓶中，用流动相稀释定容，取适量过0.2 μm滤膜，即得。

3 结果与讨论

3.1 UPLC-Q-TOF-MS方法的优化

目前欧洲药典9.6版检测盐酸阿呋唑嗪的方法为高氯酸溶液与乙腈用梯度洗脱进行分析[21]，由于高氯酸为无机酸，无法直接进入质谱进行样品分析，因此需要转换为挥发性流动相进行分析。经过优化最终采用乙酸铵水溶液与乙腈进行梯度洗脱，优化梯度洗脱条件后，各杂质均具有较好的质谱响应值，有利于下一步杂质的定性分析。

盐酸阿呋唑嗪的分子量小于800 Da，由于杂质结构与其相似，最终选定了质谱采集范围为m/z50～800。在质谱中获得杂质的一级谱图后，分别对各母离子优化碰撞能量，最终确定为30 eV。在最终确定的测定条件下获得各杂质的二级质谱碎片离子，并据此对各杂质的可能结构进行推导。

3.2 供试品溶液UPLC图谱

供试品溶液的UPLC图见图2，按照出峰时间依次对杂质编号1～6。盐酸阿呋唑嗪在溶液中解离，因此在UPLC图中主峰为阿呋唑嗪。杂质4与杂质5虽然未能达到基线分离，但是不影响定性分析。

图2 阿呋唑嗪供试品溶液的UPLC图谱Fig 2 UPLC chromatogram of alfuzosin

3.3 阿呋唑嗪质谱信息

样品主成分阿呋唑嗪的二级质谱图见图3。母离子峰m/z390.2149 [M＋H]＋，其碎裂途径如图4所示：由图中A示线断裂后，按照途径a进行碎裂，首先生成碎片m/z275.1505，元素组成为C14H19N4O2＋，该碎片脱去亚乙基生成m/z247.119，继续失CH2后生成m/z235.1192，继续失CH2后继续丢失两个H生成m/z219.0877；由图中B示线断裂后，失去B线右侧C11H13N4O2基团，按照途径b生成碎片m/z156.1019，进一步丢失C4H7NO，生成m/z71.0495。

图3 阿呋唑嗪的二级质谱图Fig 3 MS2 spectrum of alfuzosin

图4 阿呋唑嗪的裂解途径Fig 4 Fragmentation pathway of alfuzosin

3.4 杂质结构解析

3.4.1 杂质质谱信息 6个杂质经过UPLC-QTOF-MS分析后，获得精确分子量与二级质谱碎片。通过精确分子量利用MassHunter软件计算出分子式，各精确分子量与理论值的误差均小于5×10－6，结合二级质谱碎片推导各杂质结构，具体信息见表1。

表1 盐酸阿呋唑嗪中杂质的质谱信息Tab 1 MS information of impurities in alfuzosin hydrochloride

3.4.2 杂质结构解析 在原料药的生产过程中，杂质与原料药在结构上较相近，因此可以通过对比原料药的质谱碎裂特征鉴定杂质的化学结构[23]。本文结合阿呋唑嗪的裂解规律与杂质的碎片离子对各杂质结构解析如下。

杂质1：二级质谱图见图5，母离子m/z292.1771 [M＋H]＋，经过软件计算分子式C14H21N5O2。由于存在碎 片m/z275.1508，m/z247.1196，m/z219.0879，其形成机制参考阿呋唑嗪的a裂解途径，说明含有阿呋唑嗪部分结构（即C14H19N4O2）；碎片m/z191.0826由m/z247.1196失去一个甲氧基与两个甲基生成；碎片m/z259.1194为m/z275.1508失去CH2后，继续丢失两个H形成的。由此判断杂质1结构与可能的二级断裂机制如图6所示。

图5 杂质1的MS2质谱图Fig 5 MS2 spectrum of impurity 1

图6 杂质1可能的裂解途径图Fig 6 Proposed fragmentation pathway of impurity 1

杂质2：二级质谱图见图7，母离子m/z488.2521 [M＋H]＋，经过软件计算分子式为C24H33N5O6，比阿呋唑嗪多了C5H6O2，初步判断该基团为2-甲酰基四氢呋喃，杂质母离子丢失该基团后生成碎片m/z390.2149，同阿呋唑嗪母离子结构，碎片m/z275.1504，m/z235.1193，m/z156.1021，m/z71.0496形成机制参考阿呋唑嗪碎裂机制；碎片m/z333.1567为母离子丢失两个四氢呋喃环后，再失去氨基生成。由此可判断杂质2结构与可能的裂解机制如图8所示。

图7 杂质2的MS2质谱图Fig 7 MS2 spectrum of impurity 2

图8 杂质2可能的裂解途径图Fig 8 Proposed fragmentation pathway of impurity 2

杂质3：二级质谱图见图9，母离子m/z235.1192 [M＋H]＋，经过软件计算分子式C11H14N4O2，由于该母离子峰与阿呋唑嗪二级碎片m/z235.1192相同，初步推断二者为同一结构；其中碎片m/z219.0883形成机制参考阿呋唑嗪a途径碎裂机制；碎片m/z191.0927由母离子m/z235.1192失去一个甲氧基与一个甲基生成。由此判断杂质3的结构与可能的断裂机制如图10所示。

图9 杂质3的MS2质谱图Fig 9 MS2 spectrum of impurity 3

图10 杂质3可能的裂解途径图Fig 10 Proposed fragmentation pathway of impurity 3

杂质4：二级质谱图见图11，母离子m/z320.1726 [M＋H]＋，经过软件计算分子式为C15H21N5O3，由于存在碎片离子m/z275.1504，m/z247.1194，m/z235.1193，m/z219.088，其形成机制参考阿呋唑嗪的a裂解途径，说明含有阿呋唑嗪部分结构（即C14H19N4O2）；碎片m/z191.0905由m/z235.1193失去一个甲氧基与一个甲基生成。碎片m/z86.0604经过软件计算元素组成为C4H8NO＋，该碎片失去亚乙基后生成碎片m/z58.0292。由上可以推断杂质4的结构与可能的裂解机制如图12所示。

图11 杂质4的MS2质谱图Fig 11 MS2 spectrum of impurity 4

图12 杂质4可能的裂解途径图Fig 12 Proposed fragmentation pathway of impurity 4

杂质5二级质谱图见图13，二级母离子m/z288.1454 [M＋H]＋，经过软件计算分子式C14H17N5O2，由于存在碎片m/z247.1188，m/z219.0885，其形成机制参考阿呋唑嗪的a裂解途径，说明含有阿呋唑嗪部分结构（即C14H19N4O2）；碎片m/z191.0823形成机制参考杂质1裂解过程；碎片m/z272.1139为母离子丢失一个甲基形成的。由此判断杂质5结构与可能的二级断裂机制如图14所示。

图13 杂质5的MS2质谱图Fig 13 MS2 spectrum of impurity 5

图14 杂质5可能的裂解途径图Fig 14 Proposed fragmentation pathway of impurity 5

杂质6二级质谱图见图15，母离子m/z364.1979 [M＋H]＋，经过软件计算分子式为C17H25N5O4，碎片m/z318.1564为母离子失去C2H5O生成。碎片离子m/z275.1501、m/z247.1187、m/z235.1188、m/z219.0876形成机制参考盐酸阿呋唑嗪a裂解途径，说明含有阿呋唑嗪部分结构（即C14H19N4O2）；杂质母离子失去C11H13N4O2基团形成碎片m/z130.0859，结合盐酸阿呋唑嗪b裂解机制可以判断出C11H13N4O2基团结构；碎片m/z130.0859失去乙基生成碎片m/z102.055，继续失去CH2生成碎片m/z74.0239。由此可判断杂质6结构与可能的裂解机制如图16所示。

图15 杂质6的MS2质谱图Fig 15 MS2 spectrum of impurity 6

图16 杂质6可能的裂解途径图Fig 16 Proposed fragmentation pathway of impurity 6

3.4.3 杂质来源推测 根据表1中解析的杂质结构，结合文献报道工艺路线[4]，对各杂质来源分析如下：杂质1为合成路线里的中间体，推断为该物料未反应完全，带入了盐酸阿呋唑嗪中。目前欧洲药典9.6版收载了阿呋唑嗪7个杂质，分别为杂质A～G[21]，杂质1与欧洲药典中的杂质D结构一致，化学名为N-甲基-N-（4-氨基-6，7-二甲氧基-2-喹唑啉基）-1，3-丙二胺；杂质2结构中含有两个甲酰基四氢呋喃基团，推测为一分子的杂质1与两分子的2-四氢呋喃甲酸反应生成；杂质3为甲胺与2-氯-4-氨基-6，7-二甲氧基喹唑啉反应形成；杂质4推测为杂质1与甲酸反应生成，该杂质与欧洲药典中的杂质E结构一致，化学名为N-{3-[（4-氨基-6，7-二甲氧基）甲氨基]丙基}甲酰胺。杂质5为合成路线里的中间体，化学名为3-[N-（4-氨基-6，7-二甲氧基-2-喹唑啉基）-N-甲基氨基]丙腈，该物料未反应完全，带入了盐酸阿呋唑嗪中；杂质6为杂质1与氯甲酸乙酯反应生成。

4 小结

LC-Q-TOF-MS有利于研究化合物质谱裂解规律，通过比较药物主成分与有关物质的多级质谱数据的异同，可快速推断有关物质发生的变化，为最终确定杂质结构提供可靠信息[22]。本文采用UPLC-Q-TOF-MS法对盐酸阿呋唑嗪中的6个杂质进行了定性研究。通过盐酸阿呋唑嗪的二级质谱特征碎片离子，推导了6个杂质的结构，结合其结构推测杂质为合成过程中产生，需优化工艺路线，增加过程监控，减少甚至避免杂质的产生。本文可为盐酸阿呋唑嗪的工艺优化与质量控制提供参考。