双石清热合剂中6种有效成分的含量测定及提取工艺优化

王隆隆，张海风，杨忠杰，刘菊，黄霞，于晓涛，王瑞*（.漯河市中心医院，河南 漯河 4600；.郑州市中医院，郑州 450000；.河南省食品药品检验所，郑州 450000）

双石清热合剂是本院中医科医师在长期临床实践中以《银翘散》为基础加减裁化所得的临床验方，由金银花、黄芩、知母等14味中药组成，主要用于热毒壅盛所致发热面赤、口渴、头昏、喉肿等症。方中以金银花为君药，具有清热解毒、疏散风热功效；以黄芩、知母为臣药，具有清热燥湿、泻火解毒、滋阴润燥的功效；佐以栀子，清泻三焦火热、凉血解毒[1]。金银花、栀子、知母、黄芩等中药具有抗菌、抗炎、抗病毒、解热及增强机体免疫功能等作用[2-3]，该方常用于肺胃实热、口舌生疮、牙龈肿痛及上呼吸道感染等[4]。

本文选取金银花、黄芩、知母、栀子和牛蒡子为研究对象，建立合适的HPLC法同时测定绿原酸、栀子苷、芒果苷、黄芩苷、牛蒡苷、汉黄芩苷6种指标成分的含量。目前，双石清热合剂的制备是传统的煎药经验，并未进行系统性工艺研究，为了保证药品质量和疗效，本文通过Box-Behnken响应面法优化其提取工艺，更全面地保证了药品质量，确保了患者用药的安全性、有效性和稳定性[5]。

1 材料

1.1 中药饮片

中药饮片金银花（批号：190801）、蝉蜕（批号：191101）、生石膏（批号：191001）、连翘（批号：190201）、大青叶（批号：190401）、黄芩（批号：190901）、龙胆（批号：191101）、栀子（批号：190701）、玄参（批号：190801）、麦冬（批号：190501）、知母（批号：291101）（河南鸿博药业有限公司）；牛蒡子（批号：1708100017）、紫花地丁（批号：1710120037）、地黄（批号：1712230127）（亳州天济药业有限公司），由郑州大学药学院贾陆教授鉴定为金银花（Lonicera japonicaThunb.）、蝉蜕（Cryptotympana pustulataFabricius）、生石膏（Gypsum Fibrosuum）、连翘[Forsythia suspensa（Thunb.）Vah]、大青叶（Isatis indigoticaFort.）、黄芩（Scutellaria baicalensisGeorgi）、龙胆（Gentiana scabraBge.）、栀子（Ganiema Ellis）、玄参（Scrophularia ningpoensisHemsl）、麦 冬[Ophiopogon japonicus（L.f）Ker-GawL]、知母（Anemarrhena asphodeloidesBunge）、牛蒡子（Arctiumm lappa.）、紫花地丁（Viok yedoensisMakino）、地黄（Rehmannia glutinosaLibosch.），均为合格饮片。

1.2 试药

对照品绿原酸（批号：110753-201817，纯度：96.8%）、栀子苷（批号：110749-201718，纯度：97.6%）、芒果苷（批号：111607-201704，纯度：98.1%）、黄芩苷（批号：110715-201821，纯度：95.4%）、牛蒡苷（批号：110819-201812，纯度：95.0%）、汉黄芩苷（批号：112002-201702，纯度：98.5%）（中国食品药品检定研究院）；乙腈、甲醇均为色谱纯（美国Fisher公司）；甲酸为色谱纯（天津科密欧化学试剂有限公司）；其余试剂为市售分析纯；水为饮用水或超纯水。

1.3 仪器

岛津LC-20AD高效液相色谱仪（包括二元泵、全波长紫外检测器、柱温箱、自动进样器、工作站）；DHG-9070型电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；SB25-12D超声波清洗机（宁波新芝生物科技有限公司）；FW-80型微型高速万能试样粉碎机（天津市工兴电器厂）；AUW-120D型十万分之一电子天平（日本SHIMADZU公司）；5810R高速离心机（美国Eppendorf公司）；Milli-Q超纯水机（美国Millipore公司）。

2 方法

2.1 色谱条件

采用色谱柱为Agilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以0.5%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）为流动相进行梯度洗脱（0～20 min，8%B；20～50 min，8%～15%B；50～90 min，15%～35%B；90～100 min，35%～80%B；100～110 min，80%B；110～112 min，80%～8%B；112～120 min，8%B）；柱温30℃；进样量10 μL；流速0.8 mL·min－1，检测波长239 nm[6-7]。

2.2 对照品溶液制备

精密称取绿原酸、栀子苷、芒果苷、黄芩苷、牛蒡苷、汉黄芩苷对照品适量，分别加甲醇制成质量浓度为1.86、2.00、1.89、2.02、2.14、2.03 mg·mL－1的对照品储备液；精密量取上述各对照品储备液适量，混匀，制得质量浓度分别为127.77、166.02、36.05、826.41、113.72、295.52 μg·mL－1的混合对照品溶液，密封保存。

2.3 供试品溶液制备

按处方称取6份药材饮片，按照原工艺方法（加水8倍，煎煮2次，每次1.5 h，浓缩至500 mL）制备，取样品10 mL，置于50 mL具塞锥形瓶中，加甲醇10 mL，超声1 h，冷却后室温称重，用50%甲醇补足失重，13 000 r·min－1离心3 min，取上清液为供试品溶液。

2.4 阴性样品溶液制备

按照双石清热合剂处方比例分别称取缺金银花、栀子、知母、黄芩、牛蒡子的5份处方药材，依据“2.3”项下方法制得阴性样品溶液[8]。

2.5 专属性考察

按“2.1”项下色谱条件对混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液进行分析，结果如图1所示，阴性样品无干扰，且分离度均超过1.5，表明该色谱方法分离效果良好。

图1 双石清热合剂高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatogram of Shuangshi Qingre mixture

2.6 线性关系考察

精密量取“2.2”项下混合对照品溶液100、200、400、600、800、1000 μL，分别置于1 mL量瓶中，用甲醇定容，制成系列质量浓度对照品溶液。进样测定，以各待测成分进样量（x，μg）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程，以S/N约为3时计算检测限，以S/N约为10时计算定量限，结果见表1。

表1 各化学成分的回归方程、相关系数、线性范围、定量限及检测限Tab 1 Regression equation，correlation coefficient，linearity，LOQs and LODs of components

2.7 精密度试验

取“2.2”项下混合对照品溶液，连续进样6次，记录峰面积。结果显示绿原酸、栀子苷、芒果苷、黄芩苷、牛蒡苷、汉黄芩苷峰面积的RSD为0.81%、0.50%、0.32%、0.54%、0.65%、1.3%，表明仪器的精密度良好。

2.8 重复性试验

按处方比例称取6份各药材饮片，按照原工艺方法制备6份溶液，并按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定各成分含量。结果绿原酸、栀子苷、芒果苷、黄芩苷、牛蒡苷、黄芩苷的RSD分别为1.8%、1.6%、0.79%、2.3%、1.0%、1.7%，表明该方法重复性良好。

2.9 稳定性试验

取“2.3”项下供试品溶液，室温下存放 0、6、12、24、48 h，进样后测定，记录各指标成分峰面积，计算RSD。结果显示绿原酸、栀子苷、芒果苷、黄芩苷、牛蒡苷、汉黄芩苷峰面积的RSD分别为2.4%、3.0%、0.99%、3.2%、1.3%、2.0%，表明样品溶液在室温条件下48 h内稳定。

2.10 加样回收试验

取“2.8”项下已知含量的供试品溶液1 mL，分别置于2 mL离心管中，精密加入“2.2”项下混合对照品溶液0.5、1、1.5 mL，进样测定，计算出各成分含量和回收率。结果表明各成分平均回收率在98.7%～103.7%，RSD均＜5%，说明方法准确度良好。

2.11 样品含量测定

取已知含量双石清热合剂3批（批号：20190903、20191209、20200203），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算3批样品的含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果(μg·mL－1)Tab 2 Content determination in sample (μg·mL－1)

3 Box-Behnken响应面法试验优化提取工艺

3.1 评分方法

由于经验性加权评分方法容易主观性干扰，本试验根据6种指标成分的重要程度结合含量测定结果，采用SPSS软件降维因子分析与“归一法”相结合的评分方法[2，9]。结果显示绿原酸、栀子苷、芒果苷、黄芩苷、牛蒡苷、汉黄芩苷的权重系数分别为0.1921、0.0856、0.1101、0.2286、0.1749、0.2126，即综合评分Y＝0.1921X1＋0.0856X2＋0.1101X3＋0.2286X4＋0.1749X5＋0.2126X6（X为指标成分）。

3.2 单因素试验

① 吸水率试验：按处方量比例称取中药饮片，考察药材浸泡不同时间的吸水率（室温约22℃），结果药材浸泡40 min时吸水率达到17.5%，吸水较快；浸泡120 min时吸水率为24.3%，达到饱和。

② 加水量试验：按处方量比例称取中药饮片，考察煎煮90 min，煎一次条件下不同加水量（4、6、8、10、12、14倍）的评分结果。

③ 煎煮时间试验：按处方量比例称取中药饮片，考察加10倍量水，煎一次条件下不同煎煮时间（60、80、100、120 min）的评分结果。

④ 煎煮次数试验：按处方量比例称取中药饮片，考察加10倍量水，煎100 min条件下不同煎煮次数（1、2、3、4次）的评分结果。

结果见图2，根据单因素试验结果，药材吸水0.24倍，对实际影响较小，故本试验采用浸泡40 min，加水量8、10、12倍，煎煮80、100、120 min，煎煮1、2、3次进行后续优化试验。

图2 单因素试验Fig 2 Single-factor experiment

3.3 Box-Behnken响应面试验优化提取工艺

3.3.1 Box-Behnken响应面试验设计 在单因素试验的基础上，本试验以加水量（A）、煎煮时间（B）、煎煮次数（C）为考察因素，采用Design-Expert v.8.0.6软件，按照Box-Behnken响应面法设计原理，以6个成分指标的综合得分为响应值，进行三因素三水平试验设计。因素水平设计见表3，结果见表4[10]。

表3 因素与水平Tab 3 Factor and level

表4 响应面试验设计方案与结果Tab 4 Design and result of the response surface test

3.3.2 模型结果分析 采用Design-Expert v.8.0.6软件对表5的试验数据进行二次多项式回归拟合，得到综合得分Y＝2.29＋0.024A＋0.044B＋0.22C－0.044AB＋0.018AC－0.020BC－0.04A2－0.091B2－0.15C2，结果见表5。

由表5可知，在回归方程中一次项B、C，二次项B2、C2为显著项（P＜0.05），交互项AB、AC、BC均不显著（P＞0.05）；整体模型P＜0.05，表示该模型可以用于指标评分的分析和预测，且各指标对综合评分的影响C（煎煮次数）＞B（煎煮时间）＞A（加水量）。采用Design-Expert v.8.0.6软件绘制各影响因素的响应面图，见图3。由图3可知交互因素BC＞AC＞AB。

图3 各因素交互作用对综合评分影响的响应面图Fig 3 Response surface of the interaction of various factors on the comprehensive score

表5 方差分析结果Tab 5 Analysis of variance

3.4 最优结果的确定

采用Design-Expert v.8.0.6软件预测的最佳工艺为加水10.66倍，煎煮101.62 min，煎煮2.73次，综合评分2.379。根据单因素试验及实际工艺要求，最终确定工艺为浸泡40 min，加水量为10倍量，煎煮3次，每次100 min。

3.5 验证试验

按处方比例称取各中药饮片，按照“3.4”项下工艺方法，平行进行3次试验。按照“2.1”项下色谱方法同时测定6种成分含量，并计算出综合评分。结果显示3份样品的综合评分分别为2.357、2.337、2.399，与预测工艺综合评分2.382偏差[偏差＝（最优值－预测值）/ 预测值×100%]分别为1.05%、1.89%、－0.71%，表明该提取方法实测值和预测值拟合较好，表明该工艺方法稳定可行。

4 讨论

本试验考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.5%磷酸、乙腈-0.5%甲酸几种流动相搭配，最终确定了以乙腈-0.5%甲酸水溶液梯度洗脱进行双石清热合剂中6种有效成分测定，结果显示各成分特征峰的分离度均高于1.5，且峰形较好。

本试验根据单因素试验结果，通过Design-Expert v.8.0.6软件进行响应面试验，选择出了加10倍量水，浸泡40 min，煎煮3次，每次100 min为最佳工艺方法。该方法稳定、可靠，可作为该制剂的生产工艺。试验发现不同工艺方法下栀子苷、黄芩苷的含量变化较大，而芒果苷、牛蒡苷含量变化相对较小；随着煎煮时间的延长，绿原酸、栀子苷含量有下降趋势，黄芩苷、牛蒡苷、汉黄芩苷含量有上升趋势，该制剂的清热，抗炎、抗病毒效果可能会随煎煮时间的延长而改变[11-12]。

综上所述，本文建立了测定6种有效成分的HPLC法，进一步利用Box-Behnken响应面法优化提取工艺，可有效地保证该制剂疗效可控、质量稳定，确保患者用药安全。本研究也为医院新制剂的研发、生产、质控提供参考。