基于超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱技术的止得咳颗粒化学成分研究

黄光强，梁洁，3*，孙正伊，陈晓思，林婧，韦金玉，黄冬芳，周昱杉，赵立春，3*（.广西中医药大学，南宁 53000；.广西中医药大学附属瑞康医院，南宁 5300；3.广西壮瑶药工程技术研究中心，南宁 53000）

止得咳颗粒是由黄芩、射干、薄荷、荆芥、柴胡、桔梗、枇杷叶、白前、青天葵和龙脷叶10味中药配伍而成，长期的临床实践证明该方具有清热解毒、止咳化痰之功效，尤其是在治疗感冒咳嗽及支气管哮喘等方面具有显著疗效[1]。目前，国内外对止得咳颗粒质量控制及化学成分的研究较少。在止得咳颗粒质量方面，仅仅局限于对白前、射干及黄芩中的个别成分进行分析，并未将桔梗、枇杷叶等药味中的化学成分纳入到该方的质量控制系统之中[2]。在化学成分方面，虽已有文献对该方中单味药的化学成分进行报道，但都未系统地对止得咳颗粒化学成分进行全面研究[3-6]。此外，由于中药复方所含的化学成分受到药材与制备工艺等多方面因素的影响，导致中药复方质量参差不齐[7]。因此，本研究采用UPLCQ-Orbitrap HRMS技术对止得咳颗粒中的化学成分进行快速分析与鉴定，以明确止得咳颗粒中存在的化学成分，旨在为止得咳颗粒的药效物质基础研究提供依据，为其建立更加安全、有效、可控的质量控制体系提供参考和借鉴。

1 仪器与试药

1.1 仪器

U3000 UPLC液相色谱仪、Q-Exactive质谱仪、TraceFinder数据分析系统（美国Thermo Fisher公司）；KQ-500DB超声波清洗器（昆山市超声波仪器有限公司）；Milli-Q synergy超纯水仪（美国Millipore公司）；XS205DU电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；5430R离心机（艾本德中国有限公司）。

1.2 试药

甲醇、甲酸（色谱纯，美国Fisher公司）；乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；乙酸铵（色谱纯，上海斯信生物科技有限公司）。止得咳颗粒（广西中医药大学附属瑞康医院，批号：20190701，规格：15 g/包）。

2 方法

2.1 供试品溶液的制备

取止得咳颗粒样品1.0 g，加50 mL 50%甲醇超声提取30 min，离心后，过滤，取续滤液，进样分析。

2.2 分析条件

2.2.1 色谱条件 色谱柱为Thermo Hypersil Gold C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；流动相为0.1%甲酸乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）（含10 mmol乙酸铵）；流速0.3 mL·min－1；梯度洗脱（0～2.0 min，5%A；2.0～42.0 min，5%～95%A；42.0～47.0 min，95%A；47～50 min，95%～5%A）；柱 温35℃；进样量1 μL。

2.2.2 质谱条件 离子源采用HESI源（heated ESI），正、负离子检测模式；辅助气体流量：10 μL·min－1；鞘气体积流量：30 μL·min－1；喷雾电压：3.5 kV（＋）、3.2 kV（－）；辅助气温度：300℃。离子传输管温度：320℃。扫描方式为Full MS/dd-MS2模式，其中一级Full MS全扫描选择分辨率为70 000 FWHM，dd-MS2的二级扫描选择分辨率为17 500 FWHM，正、负离子扫描m/z范围：100～1500，特定离子扫描模式为“off ”，顶点激发2～8 s，碰撞气为高纯氮，喷雾气为氮气。

2.3 数据处理

利用美国Thermo Fisher公司的TraceFinder数据分析软件，拟合得到分子式和一级质谱的精确相对分子质量，将所对结果与现有数据库进行比对，对各色谱峰进行初步推测。利用目标化合物的一级碎片离子和二级碎片离子信息与参考文献及Chemspider、massbank等数据库进行比对，进一步推测和鉴定未知化学成分。

3 结果

在正、负离子检测模式下，获得止得咳颗粒的总离子流图（见图1），共鉴定得到30个化学成分，包括12个黄酮及其苷类化合物，9个有机酸类化合物，3个含氮类化合物，6个其他类化合物。被鉴定化合物的相关信息见表1。

图1 止得咳颗粒正模式（A）和负模式（B）总离子流图Fig 1 Total ion chromatogram of Zhideke granules in both positive（A）and negative（B）modes

表1 基于超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱技术鉴定止得咳颗粒中的化学成分Tab 1 Chemical components in Zhideke granules identified by UPLC-Q-Orbitrap HRMS

续表1

3.1 黄酮类成分

黄酮类化合物是指两个苯环通过三个碳原子相连形成带有C6-C3-C6母核的一类有机化合物。羟基、甲基及甲氧基等基团在黄酮类化合物中十分常见，故其质谱裂解规律主要是失去CO、H2O、CO2及侧链取代基[10]。以化合物7为例，由一级质谱可知其准分子离子峰为m/z359.0762 [M-H]－，分子式为C18H16O8。准分子离子峰发生裂解，同时失去三个CH3基团，得到m/z314.0060 [M-H-3CH3]－的碎片离子。随后，m/z314.0060的碎片离子继续发生裂解，失去一个中性CO2分子，得到m/z270.0167 [M-H-3CH3-CO2]－的碎片离子。此外，准分子离子峰也能先后失去两个CH3碎片和一个中性CO2分子，产生m/z285.0392 [M-H-2CH3-CO2]－的碎片离子，结合文献[13]报道的质谱信息，推测化合物7为野鸢尾黄素。

化合物12，由一级质谱可知其准分子离子峰为m/z299.0551 [M-H]－，分子式为C16H12O6。准分子离子峰发生裂解，先后失去一个CH3和一个中性CO分子，产生m/z256.0305 [M-H-CH3-CO]－的碎片离子。同时，准分子离子峰也可失去一个中性CO2分子，得到m/z255.0305 [M-H-CO2]－的碎片离子。随后m/z255.0305的碎片离子继续裂解，失去一个CO的中性分子，产生m/z227.0338[M-H-CO2-CO]－的碎片离子。m/z151.0029 [M-HC9H8O2]－的碎片离子是由准分子离子峰m/z299.0551发生逆狄尔斯-阿尔德（RDA）裂解反应，失去C9H8O2的碎片基团所产生的，随后m/z151.0029的碎片离子继续裂解，失去一个CO2的中性分子，得到m/z107.0135 [M-H-C9H8O2-CO2]－的碎片离子，由此推测化合物12为香叶木素[16]，并推测其可能的裂解路径见图2。

图2 香叶木素可能的裂解路径Fig 2 Possible fragmentation pathway of diosmetin

依据上述黄酮类成分的裂解规律，推测化合物8、9、10和11分别为鸢尾黄酮乙素、黄芩素、汉黄芩素和白杨素。

自然界中的黄酮类成分大多以苷类的形式存在，因此，糖苷键的断裂是黄酮苷类成分最主要的裂解路径，其苷元的裂解路径则与黄酮类成分的裂解规律一致。对化合物2进行分析，由一级质谱可知其准分子离子峰为m/z461.1078[M-H]－，分子式为C21H22O11。准分子离子峰的糖苷键发生裂解，失去C6H10O5的碎片基团，产生m/z299.1078 [M-H-C6H10O5]－的黄酮苷元碎片离子。得到的苷元碎片离子继续裂解，分别失去一个CH3基团和一个中性CO2分子，分别产生m/z284.0317 [M-H-C6H10O5-CH3]－和255.0293[M-H-C6H10O5-CO2]－的特征碎片离子。随后，m/z284.0317的碎片离子继续发生裂解，失去一个中性CO2分子，得到m/z240.0326 [M-H-C6H10O5-CH3-CO2]－的碎片离子，由此推测出化合物2为射干苷[9]，其可能的裂解路径见图3。

图3 射干苷可能的裂解路径Fig 3 Possible fragmentation pathway of tectoridin

化合物6，由一级质谱可知其准分子离子峰m/z459.0921 [M-H]－，分子式为C22H20O11。准分子离子峰糖苷键发生断裂，失去一分子葡萄糖醛酸C6H8O6碎片，产生m/z283.0602 [M-H-C6H8O6]－的碎片离子。随后，准分子离子峰继续裂解，失去一个CH3碎片，产生m/z268.0370 [M-H-C6H8O6-CH3]－的碎片离子，结合参考文献提供的质谱信息[12]，推测化合物6为汉黄芩苷。

根据上述黄酮苷类成分的裂解规律，推测化合物1、3、4和5分别为野黄芩苷、橙皮苷、黄芩苷和木蝴蝶苷A。

3.2 有机酸类成分

止得咳颗粒中的有机酸主要成分存在于枇杷叶、桔梗、薄荷等药味中。按其与羧基所连的基团不同，将其分为脂肪酸和芳香酸。脂肪有机酸是指羧基与烃基相连形成的化合物，其裂解规律通常表现为先失去一分子的H2O、CO和CO2，随后则会失去烃基等碎片离子。对化合物13进行分析，由一级质谱得其准分子离子峰为m/z191.0554[M-H]－，分子式为C7H12O6。准分子离子峰发生裂解，失去两分子H2O和一个中性CO分子，产生m/z127.0398 [M-H-2H2O-CO]－的碎片离子。此外，准分子离子峰也可失去三分子H2O和一个中性CO2分子，产生m/z93.0343 [M-H-3H2O-CO2]－的碎片离子，由此推测化合物13为右旋奎宁酸[17]。

化合物14，由一级质谱信息得其准分子离子峰为m/z191.019 [M-H]－，分子式为C6H8O7。准分子离子峰发生裂解，失去一分子H2O，产生m/z173.0085 [M-H-H2O]－的碎片离子，得到的此碎片离子继续裂解，失去一分子H2O和一个中性CO2分子，产生m/z111.0084 [M-H-2H2O-CO2]－的碎片离子。同时，m/z173.0085的碎片离子也可直接失去一个中性CO2分子，得到m/z129.0189[M-H-H2O-CO2]－的碎片离子。此外，准分子离子峰也可先后失去一个中性CO2分子，产生m/z102.9488 [M-H-2CO2]－的碎片离子，由此推测化合物14为柠檬酸[17]。

化合物21，由一级质谱得其准分子离子峰为m/z187.0969 [M-H]－，分子式为C9H16O4。准分子离子峰发生裂解，失去一个中性CO2分子，产生m/z143.1070 [M-H-CO2]－的碎片离子，得到的碎片离子继续裂解，失去一分子H2O，产生m/z125.0967 [M-H-CO2-H2O]－的碎片离子，然后继续裂解，分别失去C2H4和C4H8的碎片，产生m/z97.0654 [M-H-CO2-H2O-C2H4]－和m/z69.0342[M-H-CO2-H2O-C4H8]－的碎片离子，推测化合物21为壬二酸[17]，并推测其可能的裂解路径见图4。

图4 壬二酸可能的裂解路径Fig 4 Possible fragmentation pathway of azelaic acid

芳香酸一般是指分子结构中同时含有苯环和羧基的一类化合物。这类化合物在发生质谱裂解时易失去芳香侧链基团，随后失去CO2、H2O和CO等中性分子。对化合物16进行分析，由一级质谱可知其准分子离子峰为m/z197.0448[M-H]－，分子式为C9H10O5。准分子离子发生裂解，失去一分子H2O，产生m/z179.0343 [M-HH2O]－的碎片离子，得到的碎片离子继续裂解，分别失去一个中性CO分子和一个中性CO2分子，同时产生m/z151.0399 [M-H-H2O-CO]－和m/z135.0369 [M-H-H2O-CO2]－的特征碎片离子。此外，准分子离子峰中的苄基碳也能发生裂解，失去C7H8O2的碎片基团，产生72.9928 [M-HC7H8O2]－的碎片离子，由此推测化合物16为丹参素[18]，并推测其可能的裂解路径见图5。

图5 丹参素可能的裂解路径Fig 5 Possible fragmentation pathway of danshensu

化合物17，由一级质谱信息可知其准分子离子峰为m/z353.0867 [M-H]－，分子式为C16H18O9。准分子离子发生裂解，分别失去C7H10O5和C9H6O3的碎片基团，产生m/z179.0343 [M-H-C7H10O5]－和m/z191.0554 [M-H-C9H6O3]－的碎片离子，随后m/z191.0554 [M-H-C9H6O3]－的碎片离子继续裂解，脱去一分子H2O，产生m/z173.0448 [M-H-C9H6O3-H2O]－的碎片离子，由此推测化合物17为隐绿原酸[17]，其可能的裂解路径见图6。

图6 隐绿原酸可能的裂解路径Fig 6 Possible fragmentation pathway of cryptochlorogenic acid

化合物20，由一级质谱信息可知其准分子离子峰为m/z537.1027 [M-H]－，分子式为C27H22O12。m/z493.1027 [M-H-CO2]－的碎片离子是由准分子离子峰失去一个CO2分子所产生的，随后，其继续裂解，分别失去C9H10O5和C9H8O4的碎片离子，产生m/z295.0601 [M-H-CO2-C9H10O5]－和m/z313.0710 [M-HC9H8O4]－的碎片离子，得到的m/z295.0601碎片离子继续裂解，失去C11H6O3的碎片基团，产生m/z109.0291[M-H-CO2-C9H10O5-C11H6O3]－的碎片离子，由此推测化合物20为紫草酸[20]。

依据上述芳香酸的裂解规律，推测化合物15、18和19分别为没食子酸、咖啡酸和对羟基肉桂酸。

3.3 含氮类成分

含氮类化合物主要是指分子结构中含有氮元素的一类有机化合物，主要包括核苷、氨基酸和烟酰胺等。止得咳颗粒中的含氮类化合物主要来源于薄荷、柴胡等药味。含氮化合物质谱裂解规律主要表现为失去H2O、CO2、NH3、COOH及OH等碎片基团。同时，核苷类化合物之间的核苷键易发生断裂。对化合物22进行分析，由一级质谱得到其准分子离子峰为m/z182.0803 [M＋H]＋，分子式为C9H11NO3。准分子离子峰发生裂解，失去一个COOH碎片基团，产生m/z136.0751 [M＋H-HCOOH]＋的碎片离子，该碎片离子继续裂解，失去一个CH3碎片，得到m/z119.0488 [M＋H-COOH-NH3]＋的碎片离子。此外，准分子离子峰也可能发生另一种路径的裂解，同时失去一个OH基团和一个NH3分子，产生m/z147.0434 [M＋H-H2O-NH3]＋的碎片离子。m/z147.0434的碎片离子失去C2H3O2的碎片离子得到m/z91.0543 [M＋H-OH-NH3-C2H3O2]＋的碎片离子，由此推测化合物22为L-酪氨酸[10]，其可能的质谱裂解路径见图7。

图7 L-酪氨酸可能的裂解路径Fig 7 Possible fragmentation pathway of L-tyrosine

化合物23，在负离子模式下得到的准分子离子峰为m/z243.0615 [M-H]－，分子式为C9H12N2O6。准分子离子峰发生裂解，分别失去C5H8O4和C5H9O4碎片基团，同时得到m/z111.0198 [M-H-C5H8O4]－和m/z110.0245 [M-H-C4H7NO4]－的碎片离子。随后，m/z110.0245的碎片离子继续裂解，失去一个中性CO分子，产生m/z82.0296 [M-H-C5H9O4-CO]－的碎片离子，由此推测化合物23为尿苷[21]，其可能的裂解路径见图8。

图8 尿苷可能的裂解路径Fig 8 Possible fragmentation pathway of uridine

化合物24，由一级质谱得到其准分子离子峰为m/z123.0548 [M＋H]＋，分子式为C6H6N2O。准分子离子峰发生裂解，失去一个中性CO分子，产生m/z95.0606 [M＋H-CO]＋的碎片离子。此外，准分子离子峰也可先后失去一个NH3分子和一个中性CO分子，得到m/z78.0341 [M＋H-NH3-CO]＋的碎片离子。同时，苯环与羰基所连的C-C键和吡啶环也可发生裂解，分别失去CHN和CONH碎片基团，分别得到m/z96.0444 [M＋H-CHN]＋和m/z80.0497 [M＋H-CONH]＋的碎片离子，由此推测化合物24为烟酰胺[22]。

3.4 其他类成分

止得咳颗粒中除了上述的化学成分之外，还存在一些其他类化合物，包括糖类、酚类及少量的挥发性成分等。对化合物25进行分析，由一级质谱得到其准分子离子峰为m/z181.0711 [M-H]－，分子式为C6H14O6。分子离子峰发生裂解，失去一分子H2O，产生m/z163.0670 [M-H-H2O]－的碎片离子，此碎片离子继续裂解，分别失去C2H6O2、C4H8O3和C3H6O2的碎片基团，得到m/z101.0240 [M-HH2O-C2H6O2]－、m/z59.0136 [M-H-H2O-C4H8O3]－和m/z89.0241 [M-H-H2O-C3H6O2]－的碎片离子。随后，m/z89.0241的碎片离子继续裂解，失去一分子H2O，产生m/z71.0135 [M-H-2H2O-C3H6O2]－的碎片离子，由此推测化合物25为甘露醇[23]，其可能的质谱裂解路径见图9。

图9 甘露醇可能的裂解路径Fig 9 Possible fragmentation pathways of mannitol

化合物26，由一级质谱得到其准分子离子峰为m/z341.1078 [M-H]－，分子式为C12H22O11。准分子离子峰发生裂解，失去C9H16O8的碎片基团，产生m/z89.0241 [M-H-C9H16O8]－的碎片离子；随后，此碎片离子离子继续裂解，失去一分子H2O，产生m/z71.0136 [M-H-C9H16O8-H2O]－的碎片离子，这与文献[24]报道的质谱数据信息基本相同，由此推测化合物26为蔗糖。同理，并结合文献[25]，推测化合物27为棉籽糖。

化合物28，在正离子模式下的准分子离子峰为m/z127.0384 [M＋H]＋，分子式为C6H6O3。准分子离子m/z发生裂解后，先后失去一个H2O和一个中性CO分子，产生m/z81.0337 [M＋H-H2OCO]＋的碎片离子，此碎片离子继续裂解，失掉一个中性CO分子，产生m/z53.0392 [M＋H-H2O-2CO]＋的碎片离子。此外，准分子离子也能失去两个CO中性分子，得到m/z71.0495 [M＋H-COCO]＋的碎片离子，由此推测化合物28为5-羟甲基糠醛[26]。

化合物29，由一级质谱信息得到其准分子离子峰为m/z137.0238 [M-H]－，分子式为C7H6O3。准分子离子峰发生裂解，分别失去一个中性CO分子、一个中性CO2分子和一个CHO碎片基团，同时生成m/z109.0213 [M-H-CO]－、m/z93.0342[M-H-CO2]－和108.0213 [M-H-CHO]－的碎片离子。随后，得到的m/z109.0213碎片离子继续裂解，失去一个中性CO分子，产生m/z81.0343[M-H-2CO]－的碎片离子，结合参考文献[27]的质谱信息，推测化合物29为原儿茶醛。

化合物30，由一级质谱可知其准分子离子峰为m/z623.1966 [M-H]－，分子式为C29H36O15。准分子离子峰发生裂解，失去咖啡酰基C9H6O3，产生m/z461.1658 [M-H-C9H6O3]－的碎片离子。同时，准分子离子也可失去C20H28O11碎片基团，产生m/z179.0343 [M-H-C20H28O11]－的碎片离子；随后此碎片离子继续裂解，失去一个H2O分子，产生m/z161.0238 [M-H-C20H28O11-H2O]－的碎片离子，结合参考文献[28]的质谱碎片信息，推测化合物30为异麦角甾苷。

4 讨论

本研究利用UPLC-Q-Orbitrap HRMS技术对止得咳颗粒中的化学成分进行了分析，共鉴定出30个化学成分，结果表明其含有的主要成分为黄酮类及其有机酸类化合物。黄酮类成分具有抗菌、抗病毒、抗炎、解热及镇咳的药理活性[29]，有机酸类成分大多具有止咳平喘及抗炎、抗菌和抗病毒的作用[30-31]。这与止得咳颗粒在临床上用于感冒咳嗽、止咳化痰的作用基本一致，为该方在临床上更好地应用提供了科学依据。但有关龙脷叶、青天葵等壮药的研究较少，其中的许多化学成分都不明确，故无法对某些鉴定出的化学成分的来源进行归属。加之，由于现有数据库及文献资料的限制，仅从质谱的角度对化合物结构进行鉴定仍然存在一定的困难。因此，后续研究过程还需要进一步通过与对照物比对，并结合制备液相及大孔吸附树脂等方法对止得咳颗粒中的化学成分进行分离纯化，并连同氢谱、碳谱及IR光谱等方法对分离得到的化合物的结构进行确认，以明确止得咳颗粒中的化学物质基础，为该方进一步的质量控制及药效物质基础研究提供参考与借鉴。