系统性硬化症患者血浆7种miRNA水平与脏器累及和临床指标的相关性*

黄赛赛，王丹丹，张卓亚，梁军(南京大学医学院附属鼓楼医院风湿免疫科，南京 210008)

系统性硬化症或硬皮病是一种女性多发的自身免疫性疾病，主要特征是皮肤和内脏器官的纤维化以及血管病变和免疫功能异常，其确切的发病机理尚未完全明确[1-2]。MicroRNA(miRNA)是一类由内源性基因编码的长度约20～22个核苷酸的单链非编码RNA序列，在许多生物学过程中(如细胞增殖、分化、凋亡以及免疫细胞发育等)起着至关重要的作用[3-4]。近年来研究发现，miRNA在血液中稳定表达且有可能成为疾病诊断、预后和治疗等方面的重要生物标志物之一[5-6]。自身免疫病(autoimmune diseases，AID)患者血液中也存在miRNA的异常表达，而差异表达的miRNA可能影响AID的发生和发展[7-8]。血浆miRNA对于系统性硬化症患者的意义也越来受到重视。本研究通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测系统性硬化症患者和健康人对照血浆中7种miRNA即miR-140-5p、miR-21、miR-142-3p、miR-29a、miR-92a、miR-151-5p、let-7g的表达，并与患者的临床指标进行相关性分析，进一步探究血浆miRNA对于系统性硬化症患者的临床意义。

1 材料和方法

1.1研究对象 选取2014年4月至2017年5月就诊于南京大学医学院附属鼓楼医院风湿免疫科的49例系统性硬化症患者，女性43例，男性6例，年龄(48.8±2.1)岁，病程(6.6±0.8)年，体重(53.2±1.3)kg，77.6%(n=38)的患者有雷诺现象，32.7%(n=16)的患者合并肺动脉高压，20.4%(n=10)的患者合并高血压，42.9%(n=10)的患者有胃肠道累及，48.9%(n=24)的患者合并间质性肺炎，28.6%(n=14)的患者存在肾功能异常。所有患者均符合2013ACR/EULAR关于系统性硬化症的诊断标准[9]，排除急性感染，肿瘤，其他确定的AID。所有患者均服用≤10 mg/d的醋酸泼尼松。同时选取年龄和性别相匹配的体检健康者20例作为健康人对照。所有标本均在患者入院第二天清晨空腹采集，血浆样本在使用前均于-80 ℃保存。本研究经医院医学伦理委员会批准(批准文件号2008017)，患者均知情同意。

1.2仪器与试剂 Sigma 2-16K离心机(德国Sigma公司)，RNA逆转录仪(日本TaKaRa公司)，Step-one PlusTM荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)，BC-6800Plus血液分析仪(迈瑞公司)，生化分析仪(北京迈克公司)。

miRNeasy Serum/Plasma Kit、miScript II RT Kit、miScript SYBR Green PCR Kit(Qiagen公司)，BC-6800Plus血液分析仪配套肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白、总蛋白、补体C3、补体C4、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白E(IgE)、免疫球蛋白M(IgM)(荧光染色法)试剂(迈瑞公司)，肌酐检测(酶法)试剂、尿素氮检测(尿素氮UV法-氨去除法)试剂(日立化成诊断系统株式会社)，微量白蛋白检测(免疫比浊法)试剂(奥瑞雅诊断公司)，微量总蛋白测定(领苯三酚红比色法)试剂(德国德赛公司)，补体C3、C4、IgA、IgG、IgM测定(免疫比浊法)试剂(北京迈克公司)，IgE测定(免疫比浊法)试剂(上海景源公司)。

1.3病例资料的采集 运用电子病历系统，收集入组系统性硬化症患者与miRNA检测和实验室检查时间点一致的病历资料，包括白细胞、淋巴细胞、肌酐、尿素氮、24小时尿蛋白、总蛋白、补体C3、补体C4、IgA、IgG、IgE、IgM。

1.4血浆miRNA的提取 使用miRNeasy Serum/Plasma Kit试剂盒分离miRNA，按说明书进行操作。

1.5cDNA的合成 使用miScript II RT Kit合成cDNA，按说明书冰上配制逆转录体系，在RNA逆转录仪上37 ℃ 60 min、95 ℃ 5 min完成逆转录反应，合成cDNA。

1.6qRT-PCR检测血浆miRNA的相对表达 使用miScript SYBR Green PCR Kit进行qRT-PCR检测，miR-39作为加标对照。hsa-miR-140-5p、hsa-miR-21、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-29a、hsa-miR-92a、hsa-miR-151-5p、hsa-let-7g、cel-miR-39的引物序列见表1，由日本TaKaRa公司合成。实时PCR反应条件：94 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s,共40个循环，所有反应均在Step-one PlusTM荧光定量PCR仪上进行。用2-△△Ct方法计算血浆miRNA的表达。

表1 miRNA引物序列

1.7统计学分析 用SPSS 17.0软件进行。数据符合正态性分布，以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验。相关性分析用Spearman相关。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1系统性硬化症患者血浆miRNA的表达 qRT-PCR结果发现，系统性硬化症患者血浆miR-21、miR-142-3p、miR-29a、 miR-92a、miR-151-5p、let-7g的水平较健康人对照明显下降，差异有统计学意义。见表2。

表2 系统性硬化症患者与健康人对照血浆miRNA对比

2.2系统性硬化症患者血浆miRNA与脏器累及的关系 根据患者是否合并高血压、肺动脉高压、间质性肺病、胃肠道累及、雷诺现象，将患者进行分组分析，对比不同类型患者血浆miRNA水平。结果发现合并肺动脉高压的患者miRNA-21和miRNA-142-3p水平较无肺动脉高压患者明显升高(见表3)，两组之间其余miRNA的表达差异无统计学意义。而是否合并高血压、间质性肺病、胃肠道累及、雷诺现象、肾脏累及对系统性硬化症患者血浆miR-140-5p、miR-29a、miR-92a、miR-151-5p、let-7g的表达无明显影响。

表3 无肺动脉高压组和合并肺动脉高压组血浆miRNA-21和miRNA-142-3p的表达水平

2.3系统性硬化症患者血浆miRNA与实验室指标的相关性 结果显示，miRNA-140-5p与IgG水平正相关，miRNA-21与IgA、IgG水平正相关，miRNA-92a与淋巴细胞计数、白细胞总数、补体C3负相关，miRNA-151-5p与IgG水平正相关，let-7g水平与IgG、IgE水平正相关，见表4。miR-142-3p、miR-29a与临床实验室指标相关性无统计学意义。

表4 系统性硬化症患者血浆miRNA水平与临床指标的相关性分析

3 讨论

miRNA可参与系统性硬化症的不同信号传导途径并调节其病理生理过程，表明他们有可能作为系统性硬化症的潜在生物学标志物，在系统性硬化症的诊断和治疗中发挥重要的作用[10]。纤维化是系统性硬化症发病的突出特征，miRNA在纤维化进程中起到重要作用，如敲除小鼠肾脏miR-21可以显著缓解肾脏纤维化的进程[11]，巨噬细胞来源的外泌体可能通过增加肺泡上皮细胞和肺成纤维细胞miR-142-3p的表达来抑制肺纤维化[12]。本研究检测了7种可能参与纤维化过程的miRNA在系统性硬化症患者血浆中的表达水平，结果显示血浆中miR-21、miR-142-3p、miR-29a、miR-92a、miR-151-5p、let-7g表达均明显下降。

肺动脉高压是系统性硬化症相关肺血管疾病的常见形式，发病率约在8%～12%，是系统性硬化症患者主要的死亡原因之一[13]。本研究发现，合并肺动脉高压组患者血浆miRNA-21和miRNA-142-3p较非肺动脉高压组升高，表明血浆miRNA-21、miRNA-142-3p可能是系统性硬化症肺动脉高压的危险因素之一。另外，miRNA-21、miRNA-142-3p在系统性硬化症患者中明显降低，而在合并肺动脉高压组升高，这表明血浆miRNA-21、miRNA-142-3p可能具有双向作用，在不同的内环境中发挥不同的作用，其具体机制仍有待进一步研究。

我们将系统性硬化症血浆miRNA相对表达量与患者临床指标进行相关性分析，结果显示miRNA水平与患者白细胞、淋巴细胞、补体以及免疫球蛋白存在一定的相关性，这表明血浆miRNA与系统性硬化症患者的机体免疫反应密切相关，对于种种现象的存在及其机制也将是我们后续研究的重点。

本研究也存在一些局限性。首先入组的病人数量较少，仍需要更大样本量的研究来进一步探讨血浆miRNA对于系统性硬化症患者的意义。其次，入组的患者几乎都是弥漫性硬皮病，缺乏对局限性硬皮病患者的研究。最后，本研究为横断面的研究，暂无患者的随访数据，没有对患者疗效和miRNA水平的动态观察。这些不足有待在以后的工作中弥补。