双重过滤法联合MALDI-TOF MS快速检测尿液病原菌*

徐金莲，陈学兵，李书琴，肖学会，王沛(荆门市第一人民医院检验科，湖北荆门448000)

尿路感染是人类较常见的感染性疾病，作为诊断金标准的中段尿细菌定量培养耗时长且存在培养阴性现象，不利于临床快速诊断及排除尿路感染。UF1000i尿沉渣自动化分析仪能准确提供白细胞和细菌含量，常用于尿路感染的筛查。全自动细菌鉴定分析仪虽可于当日完成病原菌鉴定，然而鉴定前需培养出单菌落。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)具有快速鉴定病原菌的优点，可将已培养的病原菌鉴定时间缩短至数分钟，成为临床实验室的常规鉴定方法[1]。MALDI-TOF MS还能直接检测阳性血培养和尿液等体液中的病原菌，省去了培养环节，进一步缩短了病原菌的鉴定时间[2-3]。由于标本中存在影响质谱峰质量的细胞、蛋白质等干扰因素，需要对标本中病原菌富集纯化后方可提高MALDI-TOF MS鉴定的准确率。目前国内外学者采用的富集纯化方法处理时间均较长，操作繁琐。本研究利用UF1000i细菌计数结果对中段尿标本进行初筛，应用2个针式过滤器组成的双重过滤器对初筛阳性的中段尿标本进行双重过滤以富集纯化病原菌，运用MALDI-TOF MS对滤膜上富集的病原菌进行鉴定，旨在为临床尿路感染病原菌的快速诊断提供简单可靠的检测方法。

1 材料与方法

1.1标本来源及处理 收集2020年5—8月荆门市第一人民医院门诊及住院疑似尿路感染患者中段尿标本1 583份。标本采集量约20 mL，并分为3份，分别用于细菌定量培养及鉴定、UF1000i细菌计数和细菌计数阳性标本的过滤集菌及鉴定。

1.2主要仪器与试剂 UF1000i全自动尿沉渣分析仪、UFII PACK-BAC稀释液(日本希森美康公司)；microflex LT MALDI-TOF质谱分析仪、样品处理基质α-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)、大肠埃希菌DH5α(德国布鲁克道尔顿公司)；哥伦比亚血琼脂及麦康凯琼脂(郑州安图生物公司)；一次性水系针式过滤器、水系微孔滤膜(上海兴亚净化材料厂)，可换膜针式过滤器(桃园医疗化工仪器厂)；甲酸、三氟乙酸及乙腈(天津市大茂化学试剂厂)。

1.3双重过滤器制作 上层预过滤滤器为5 μm孔径一次性密闭针式过滤器，下层滤器为可放置不同孔径微孔滤膜的可换膜针式过滤器，两个过滤器直接串联成双重过滤器。过滤尿液时，先将浸泡于去离子水中的0.45 μm微孔滤膜置于可换膜针式过滤器中，再将装有尿液标本的注射器插入双重过滤器接口，按压过滤。双重过滤器示意图见图1。

图1 双重过滤器示意图

1.4细菌定量培养及鉴定 分别取10 μL中段尿接种血琼脂平板和麦康凯平板，置35 ℃培养18～48 h。将菌落计数≥104CFU/mL菌落用牙签挑取少许涂抹于靶板中，加入1 μL 70%甲酸溶液，待其自然干燥后，再加入1 μL配制好的基质溶液，自然晾干后将靶板放入质谱分析仪进行MALDI-TOF MS鉴定。参考卫生行业标准《WS/T489-2016尿路感染临床微生物实验室诊断》[4]，对细菌菌落计数≥104CFU/mL的中段尿标本进行细菌鉴定。2种菌生长标本仅优势菌纳入鉴定范围，培养后菌落数占比>50%的细菌判断为优势菌。2种以上细菌生长标本视为污染菌，不纳入本研究。

1.5UF1000i细菌计数 取中段尿3 mL，按UF1000i全自动尿沉渣分析仪要求进行细菌(包括真菌)计数检测。参考文献[5]，细菌计数阈值判断标准为≥105个/mL。

1.6双重过滤法集菌及鉴定 用无菌注射器抽取UF1000i细菌计数≥105个/mL的中段尿5 mL，插入双重过滤器接口，轻轻按压注射器过滤尿液，过滤完毕后吸取1 mL无菌去离子水洗涤过滤。用接种环刮取下层过滤器滤膜上的细菌并涂抹于靶板，按常规方法操作并进行MALDI-TOF MS鉴定。同时将滤膜上的刮取物涂抹于洁净的玻片上进行快速革兰染色。MALDI-TOF MS鉴定结果判断：当鉴定分值≥1.700时为鉴定结果可信，鉴定分值<1.700时为鉴定结果不可信。

1.7统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行数据统计分析。计数资料采用例数或百分数表示。利用配对χ2检验及Kappa一致性检验，分别比较UF1000i细菌计数与定量培养、双重过滤法与培养法检测结果差异及一致性。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1UF1000i细菌计数及与定量培养结果比较 1 583份中段尿标本中，UF1000i筛选出细菌计数≥105个/mL标本381份(24.1%)，其中培养后菌落数<104CFU/mL标本109份，菌落数≥104CFU/mL标本272份；1 202份细菌计数<105个/mL标本中，培养后菌落数<104CFU/mL标本1 183份，菌落数≥104CFU/mL标本19份，细菌漏检率为6.5%(19/291)。见表1。UF1000i细菌计数阈值设置为≥105个/mL时，UF1000i细菌计数与定量培养结果的阳性符合率为93.5%(272/291)，阴性符合率为91.6%(1 183/1 292)，总符合率为91.9%(1 455/1 583)。2种方法阳性率间差异有统计学意义(P<0.05)，但检测结果一致性较好(kappa=0.759)。

表1 UF1000i细菌计数与细菌定量培养结果比较

2.2双重过滤法与培养法鉴定结果比较 细菌培养菌落数≥104CFU/mL且为单一菌生长标本共229份，其中，双重过滤法鉴定出细菌的标本为211份，鉴定符合率为92.1%(211/229)，其中革兰阴性菌鉴定符合率为94.7%(177/187)，革兰阳性菌鉴定符合率为84.6%(33/39)，真菌鉴定符合率为33.3%(1/3)。43份标本为2种菌混合生长，双重过滤法未能可靠地鉴定出2种混合菌，鉴定的细菌主要为优势菌，鉴定符合率为72.1%(31/43)。见表2。381份UF1000i细菌计数阳性的中段尿标本中，272份标本菌落数≥104CFU/mL，双重过滤法鉴定出细菌生长标本242份，与培养法的鉴定符合率为89.0%(242/272)。2种方法检测结果比较差异有统计学意义(P<0.05)，但一致性较好(kappa=0.822)。

表2 双重过滤法与培养法鉴定结果比较

2.3双重过滤法与培养法中段尿标本处理流程及周转时间比较 双重过滤法利用UF1000i细菌计数对尿液标本进行快速初筛，初筛阳性标本双重过滤集菌后直接进行MALDI-TOF MS鉴定。2种方法的中段尿标本处理流程见图2。传统培养法操作简单，但中段尿标本周转时间约需18～48 h。双重过滤法在收到标本后的5 min内完成细菌计数，15 min内完成标本过滤集菌及靶板点样，30 min内完成细菌鉴定。双重过滤法中最为关键的尿液标本过滤集菌仅需2～3 min。

图2 培养法、双重过滤法的标本处理流程与时间轴

3 讨论

本研究运用的微孔滤膜双重过滤法采用2个针式过滤器直接串联成的双重过滤器，2～3 min内完成尿液标本的过滤集菌，耗时短，过滤效率高，操作简单，该双重过滤方法联合UF1000i细菌计数和MALDI-TOF MS直接对尿液中的病原菌进行快速准确的鉴定，为临床尿路感染快速诊断及治疗提供科学依据。

鉴于MALDI-TOF MS直接检测尿液中病原菌的菌量至少需要105CFU/mL[6]，以及尿路感染患者尿液中的病原菌菌落数通常高于104～105CFU/mL[7]，本研究通过UF1000i细菌计数来确定尿液标本是否需要进行过滤集菌及鉴定。1 583份尿液检测结果显示，UF1000i细菌计数与定量培养结果的符合率达到91.9%，2种方法检测结果的一致性较好(kappa=0.822)。研究表明，通过合适的阈值设置，UF1000i细菌计数可作为MALDI-TOF直接检测尿液中病原菌的检测指征与尿路感染的初筛指标，快速筛选出培养阴性占大多数的尿液标本，减少过滤及鉴定工作量。UF1000i细菌计数也正好弥补双重过滤法不能计数尿液病原菌的不足。此外，由于标本中细菌浓度与MALDI-TOF MS鉴定能力具有相关性[8]，对UF1000i细菌计数结果不高(105～106个/mL)的尿液标本，可以通过增加尿量或使用小过滤器的方法以增加富集的菌量，从而提高MALDI-TOF MS鉴定率。

本研究中，双重过滤法对229份单一菌生长尿液标本过滤集菌后的MALDI-TOF MS鉴定结果与培养法鉴定结果的符合率为92.1%，其中革兰阴性菌鉴定符合率达到94.7%，革兰阳性菌鉴定符合率为84.6%。3份真菌生长标本只鉴定出了1份，还有10份革兰阴性杆菌生长标本和6份革兰阳性球菌生长标本未能成功鉴定，可能与以下因素有关。(1)富集菌中有干扰因素。本研究中所用的上层预过滤器的滤膜孔径为5 μm，只能滤除大多数直径大于5 μm的有形成分，不被截留的小于5 μm的有形成分可能会留在下层0.45 μm孔径过滤膜上，从而影响MALDI-TOF MS鉴定。因此，双重过滤并不能完全去除尿液中的细胞及细胞破碎物、蛋白质、色素物质等可能的干扰因素。本研究对5份无鉴定结果标本的滤膜取菌涂片，革兰染色后发现有较多富集菌，但背景不干净，可能因干扰物质影响鉴定结果。(2)富集菌量较少。尿液经预过滤器过滤会被截留部分细菌，菌量不高的尿液标本过滤后富集菌量更少，使MALDI-TOF MS检测能力明显降低[6,9-10]。此外，尿液中的真菌孢子、呈链状排列或聚集成团的革兰阳性球菌及菌体长的细菌均大于预过滤器的滤膜孔径，会使过滤后的菌量大大减少。本研究中分别有3份肠球菌与2份葡萄球菌生长标本均由于细菌聚集，不能从5 μm滤膜滤出导致无鉴定结果。研究发现，当标本中菌量不高，而尿液中细胞、结晶等异常成分比较多时，尿液标本常常也无可靠鉴定结果。(3)细菌破壁效果不好。本研究中真菌鉴定率低，除了与富集菌量少有关，也可能与真菌细胞壁较难破坏有关[3,11-12]。本研究中双重过滤法对混合菌生长尿液标本鉴定率虽可达到72.1%，但鉴定的细菌主要为优势菌。由于混合菌检测是MALDI-TOF MS技术的短板，故双重过滤法不适合混合菌生长标本的鉴定。

MALDI-TOF MS直接检测尿液中病原菌的关键之处在于如何纯化富集病原菌。富集的菌量及细菌的纯度与MALDI-TOF MS鉴定的准确性具有相关性。目前文献报道的纯化富集尿液病原菌的方法主要有离心法、短期培养法和负压式过滤法[3,13-14]。研究显示，离心法联合MALDI-TOF MS对尿液单一菌生长标本准确度介于68.4%～92.9%[3,14]。短期培养法联合MALDI-TOF MS鉴定尿液病原菌，4 h培养单一菌检出率为80.1%，6 h培养检出率可达97.1%[13]。国外Veron等[14]采用负压过滤法联合MALDI-TOF MS检测尿液病原菌的准确度为78.9%，高于差速离心法的68.4%，但低于5 h培养法的84.2%。本研究采用注射器按压过滤法收集细菌。双重过滤器中5 μm孔径的上层预过滤器对尿液进行预过滤，以除去细胞、结晶等有形成分，下层可换膜式针式过滤器用于收菌细菌，过滤后直接取滤膜上细菌涂片行革兰染色，可辅助判断集菌情况。该集菌纯化法联合MALDI-TOF MS对单一菌生长尿液标本鉴定准确度可达92.1%，不亚于上述3种方法。此外，双重过滤集菌纯化法操作简便、快速，2道过滤步骤一步完成，大多数尿液标本2～3 min内完成过滤集菌，标本前处理时间远低于上述3种方法；所用过滤装置简单拼装，无需特殊设备，成本也比较低。

总之，本研究探索的双重过滤装置纯化富集尿液中病原菌的方法，具有简单、快速、经济且实用性强等特点，与UF1000i及MALDI-TOF MS联合应用，可快速排除与诊断尿路感染。