非维生素K拮抗口服抗凝药的实验室监测进展*

赵晓静，门剑龙，任静(天津医科大学总医院精准医学中心，天津300052)

非维生素K拮抗口服抗凝药(non-vitamin K antagonist oral anticoagulants，NOACs)是预防和治疗血栓性疾病的常用药物，包括达比加群酯、阿哌沙班、利伐沙班、艾多沙班等，其应用范围覆盖静脉血栓、动脉血栓以及心腔内血栓(如非瓣膜房颤相关血栓)等[1]。与华法林等传统口服抗凝药相比，NOACs直接作用于单一靶点(凝血因子Ⅹa或Ⅱa)，不易受食物和药物影响，药物代谢过程稳定，抗凝效果可预测且安全性高，无需进行常规实验监测。另一方面，在某些特定情况时，NOACs也存在一些安全性问题，其中高龄、严重肝肾功能不全、营养状况不佳或胃肠道吸收不良、肥胖或体重过轻、联合用药等因素可引起药物代谢异常(如药物蓄积或清除过快)[1-2]，而在硬膜外间隙阻滞麻醉、紧急手术或溶栓治疗前停药不充分等因素可导致残留抗凝活性过高(常引起严重出血)[2-3]。因此，利用实验室监测评估NOACs的代谢情况和抗凝活性，有助于指导治疗方案调整以及避免复杂临床背景下不良事件发生。监测NOACs的主要试验包括：液相色谱串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)、凝血酶原时间(prothrombin time，PT)、活化的部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time，APTT)、凝血酶时间(thrombin time，TT)和稀释凝血酶时间(dilute thrombin time，dTT)、抗活化因子Ⅹ活性试验(anti-FⅩa)、蝰蛇毒凝血时间(ecarin clotting time，ECT)和稀释的蝰蛇毒时间(dilute Russell viper venom time，dRVVT)等。本文结合近年来的临床研究证据和循证文献综述并评价NOACs实验室监测的临床应用进展。

1 液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)

LC-MS/MS是定量检测NOACs血药浓度的“金标准”，灵敏度高，特异性好，LC-MS/MS能测定血药浓度范围在1～500 ng/mL之间的达比加群酯、阿哌沙班和利伐沙班，可动态观察血药峰值浓度和谷值浓度，主要用于临床研究、方法学校准和药代动力学分析等[1-3]。国际血液学标准化理事会(International Council for Standardization in Haematology，ICSH)关于NOACs实验室监测的文献显示，LC-MS/MS对NOACs有较大的检测限范围，其中检测下限为0.025～3.0 ng/mL，临床报告范围为5～500 ng/mL，且精密度较好(批内CV<6%，批间CV<10%)[1]。Slavik等[4]研究显示，LC-MS/MS可有效监测达比加群酯，并与dTT有良好相关性；Al-Aieshy等[5]研究显示，LC-MS/MS可敏感反映利伐沙班血药浓度变化(血药峰值和谷值)，并与anti-FⅩa有良好相关性[1]；Mast等[6]研究显示，LC-MS/MS监测阿哌沙班时与anti-FⅩa有很强的相关性(但二者在峰值浓度出现的时间点上略有差异)；Harenberg等[7]多中心研究显示，LC-MS/MS测定尿液样本中阿哌沙班、艾多沙班和利伐沙班的灵敏度、特异性均≥95%，达比加群酯>97.5%。总体而言，LC-MS/MS适用于血、尿等临床样本，能有效评估血药浓度的变化，帮助医生识别药代动力学异常[5]。此外，LC-MS/MS也可用于包括司法鉴定样本，Wiesen等[8]利用LC-MS/MS对死亡个体的心脏血液、股骨血液、脑脊液和尿液中NOACs进行检测并获得准确的定量结果。另一方面，LC-MS/MS虽然能准确测定血药浓度，但并不能直观反映NOACs在患者循环血液中产生的抗凝活性(有效性)以及对机体止血能力的影响(安全性)[1,9]。因此，评估NOACs药代动力学和药效学之间的关系，需联合功能试验(如APTT、PT、dTT等)和临床表现做总体评估。此外，由于LC-MS/MS技术相对复杂，设备较为昂贵，操作步骤繁琐，也使该技术尚未能普及应用于临床。

2 凝血酶原时间(PT)

治疗剂量的NOACs可影响PT结果，而且多数类型的PT试剂对利伐沙班和艾多沙班的敏感性均高于阿哌沙班[10]。120～290 ng/mL的利伐沙班[11]和97～296 ng/mL的艾多沙班[12]可剂量依赖性延长PT(线性关系较弱)，当PT延长至2倍以上，提示有潜在出血风险[1-2,13]。利伐沙班是目前应用较为广泛的NOACs，PT的合理使用，对该药物在临床应用的安全性和有效性具有重要意义。Woodruff等[14]研究显示，PT能有效反映住院患者利伐沙班给药后的出血风险及药效学特征，PT≥30 s的患者的出血事件总发生率(38.7%)显著高于PT<30 s的患者(17.3%)；多变量回归模型显示，PT≥30 s患者的出血风险优势比(odds ratio，OR)为3.25(95%CI：1.09～9.66)。近年来，更多的研究证实了根据药代动力学特征选择监测PT的时间点有助于评估患者药物使用的有效性和安全性。Suzuki等[15]评估了5种PT试剂对利伐沙班治疗后的峰值(给药后2～4 h)和谷值(下一次给药前)的监测效果，并采用非线性混合效应模型对药代动力学和药效学进行建模，结果显示这些PT试验对利伐沙班药代动力学倾向具有中等预测能力。另一种NOACs——艾多沙班，与利伐沙班的体外试验特征非常相近[16]。因此，在临床上PT还可用于监测艾多沙班。Iba等[17]研究显示，艾多沙班血药浓度为0～>300 ng/mL的临床样本中，PT与anti-FⅩa活性呈正相关(尤其是血药峰值水平时)，并且与凝血酶原复合物浓缩物的逆转效应呈剂量依赖性。Parasrampuria等[18]研究显示，PT可有效反映艾多沙班的药代动力学和抗凝效应，艾多沙班给药4 d后，峰值PT为(21.8±2.46)s，与从利伐沙班或达比加群酯切换到艾多沙班后的峰值水平(21.8±2.88)s相近。Sezai等[19]研究显示，PT是监测心脏手术后心房颤动患者实施艾多沙班治疗有效性和安全性的可靠手段。需注意，虽然PT有助于监测利伐沙班和艾多沙班出血风险，但不能精确反映其抗凝活性(PT延长与血药浓度相关性弱[20-22])，仅可作为评估安全性的初筛手段，不能用于指导药物剂量调整[1,13]。

PT对治疗剂量的阿哌沙班(200 ng/mL)不敏感[9]，当PT延长达到2倍水平，所对应的血药浓度分布范围非常大(480～1 000 ng/mL)[1]。因此，PT不能反映阿哌沙班的安全性和有效性。此外，达比加群酯也会造成PT延长，但由于PT与达比加群酯的剂量关联性更差，无法反映其抗凝活性的变化。因此，PT不能进行有效监测。

利用PT监测利伐沙班和艾多沙班的注意事项包括：(1)需使用对血药浓度变化相对敏感的PT检测系统[20-22]；(2)以“s”作为PT测定值的表达方式优于国际标准化比值(INR)[1,13]；(3)在血药浓度处于峰值时检测用于评估药物疗效，在谷值时检测用于评估安全性[1-2,13,23](在评估出血风险时，谷值效果优于峰值)[3,9,14]，但任意时间PT出现>2倍延长都提示潜在出血风险。

3 活化的部分凝血活酶时间(APTT)

NOACs在治疗剂量时可使APTT出现不同程度的延长，其中APTT与利伐沙班、艾多沙班、阿哌沙班的剂量相关性差，因此不宜用于此类药物的监测[2-3,13]。既往研究证实，血中达比加群浓度与APTT呈剂量依赖性延长(非线性相关)[23]，血药浓度为100 ng/mL和200 ng/mL时，可使APTT延长至参考区间上限的1.43～1.71倍和1.67～1.97倍[2,13]。达比加群酯用药后，血药浓度可在2 h左右达峰，APTT多延长2倍左右，>2倍则提示潜在出血风险[1-2,22]；当血药浓度处于200～400 ng/mL，APTT可延长>2倍，但与血药浓度的相关性进一步弱化；当血药浓度>400 ng/mL时，APTT与血药浓度无相关性(不再进一步延长)，也无助于评估出血风险[24-25]。法国围手术期止血工作组(GIHP)建议，对于接受达比加群酯治疗的围手术期患者，如无法测定达比加群血药浓度，可采用APTT比值≤1.20为安全标准。

利用APTT监测达比加群酯的注意事项包括：(1)对药物浓度敏感性高的APTT更有助于评估安全性(一些不敏感的APTT试剂，无法安全排除血中残留的达比加群抗凝效应[26-27])；(2)基于APTT与血药浓度的关联性特征，APTT可评估给药剂量为100 mg(每日2次)的达比加群酯的安全性和有效性，而对于150 mg(每日2次)达比加群酯，仅可评估有效性[1,25]。

4 凝血酶时间(TT)和稀释的凝血酶时间(dTT)

TT对血中达比加群有高度敏感性，治疗剂量的达比加群酯可使TT延长至300 s以上，即使血药浓度接近谷值水平也常出现TT明显延长的现象(>100 s)。Solms等[23]研究显示，TT在达比加群血药浓度为42 ng/mL和182 ng/mL时，分别延长7.6倍或15.4倍。如患者停用达比加群酯后TT仍延长，则提示患者血液中残留达比加群抗凝活性[2-3]。由于TT对达比加群过度敏感，导致其与血药浓度无明确剂量相关性，且在治疗水平时TT几乎都会超出实验检测限的范围，因此无法评价达比加群酯的安全性和有效性[1,25]。另一方面，TT对达比加群酯敏感，对阿哌沙班、艾多沙班或利伐沙班不敏感[26]，而且正常水平的TT对排除达比加群的特异性为100%[27]，因此TT可作为达比加群血药浓度是否>30 ng/mL的阴性预测手段。

dTT是在TT基础上的改进方法，由于TT对患者血中达比加群过于敏感，因此dTT在检测前首先对患者血液样本进行稀释(通常用健康人混合血浆以1∶8进行稀释)，根据给药剂量或预期血药浓度，标本稀释比例最大可调整为1∶20。dTT与50～500 ng/mL之间的达比加群显著相关并能定量推导出血药浓度，当血中达比加群>200 ng/mL则提示潜在出血风险[1-2]。Slavik等[4]研究显示，与LC-MS/MS相比，dTT由于使用了非线性校准曲线，因此在较大血药浓度范围内(尤其是低浓度水平)显示出良好的分析效果，可作为达比加群酯的定量监测方法。需注意，各种dTT检测体系对达比加群敏感性不一，需使用特定校准品和对照品做性能验证[28]。

5 抗活化因子Ⅹ活性试验

基于发色底物法的抗活化因子Ⅹ活性(anti-FⅩa)试验的检测原理是FⅩa被肝素-抗凝血酶复合物中和后，残余FⅩa用显色底物定量。由于华法林、枸橼酸钠、狼疮抗凝物、Ⅷ因子活性升高和肝病等因素对anti-FⅩa几乎不产生影响，因此anti-FⅩa更为可靠[1-2,29-30]。

anti-FⅩa与治疗剂量的阿哌沙班[6]、利伐沙班[13]和艾多沙班[31]血药浓度呈线性相关，且与LC-MS/MS检测结果有良好相关性(显著优于PT)[4,32]，可定量推导出血药浓度。利用anti-FⅩa能动态观察血药峰值浓度和谷值浓度的变化趋势，评估患者药代动力学特征[1,13]，帮助医生预判抗凝过度(如剂量过大)或不足(如剂量过小或联合药物干扰)以及出血风险(尤其是药物蓄积)。近年数据显示，血药浓度<30 ng/mL是服用利伐沙班在术前停药、溶栓前停药的安全阈值，紧急手术或有创检查患者停药后如血药浓度>30 ng/mL时应进行逆转干预，>100 ng/mL是溶栓治疗的禁忌[33-34]。需注意，择期手术前停用利伐沙班≥3 d，血药浓度通常降至30 ng/mL以下，如患者应用抗心律失常药物或有中度以上肾损害，停药时间应充分(不少于3 d)[35]。Ikeda等[36]研究显示，anti-FⅩa测定可能有助于评估高危患者(如高龄、低体重和/或肾功能损害)的药效学异常；峰值时，服用利伐沙班或阿哌沙班患者的anti-FⅩa活性几乎相同，谷值时，服用利伐沙班的患者anti-FⅩa活性低于接受阿哌沙班患者。法国GIHP建议，接受利伐沙班的围手术期治疗患者，以≤30 ng/mL为安全性临界值[37]，而阿哌沙班和艾多沙班由于出血风险更低，目前尚未明确安全性临界值。

利用anti-FⅩa监测上述Ⅹa因子抑制剂的注意事项包括：(1)anti-FⅩa实验原理应为发色底物法，以确保测定结果不被试剂成分干扰[38]；(2)血药峰值浓度反映有效性(抗凝活性)，谷值浓度反映安全性(出血风险)；(3)检测不同Ⅹa因子抑制剂时，需采用相应的标准品对anti-FⅩa进行校准；(4)由于检测精度的限制，anti-FⅩa无法准确定量检测血中<15 ng/mL的阿哌沙班[39]、<30 ng/mL的利伐沙班[40]和<30 ng/mL的艾多沙班[1]；(5)评价血药浓度临床意义时，需结合PT、年龄、胃肠道功能、联合用药、临床表现等情况做综合分析。

6 蝰蛇毒凝血时间(ECT)

ECT的实验原理是试剂中的蝰蛇毒成分(一种金属蛋白酶)剪切凝血酶原(Ⅱ因子)肽片段并使之活化，此过程的中间产物活性被达比加群所抑制[41]，其抑制程度与达比加群血药浓度呈线性相关(剂量依赖性)[42]，可用于评估达比加群酯的安全性和有效性。ECT与质谱检测结果有良好的相关性，50～500 ng/mL为其最佳检测限范围。ECT延长至正常上限>3倍提示有潜在出血风险。此外，由于ECT对肝素类药物不敏感，在达比加群酯与肝素类药物桥接时，对ECT的特异性较其他试验更强[28]。

利用ECT监测达比加群酯的注意事项包括：(1)在血药浓度<40 ng/mL或> 940 ng/mL时检测性能下降[13,41](当血药浓度过高时，可用健康人混合血浆按1∶1比例稀释患者血浆)；(2)低纤维蛋白原血症或凝血酶原缺乏影响试验准确性[41]；(3)不同ECT检测体系间无统一标准(尤其是蝰蛇毒试剂浓度)，检测前需利用标准品进行校准。

7 稀释的蝰蛇毒时间(dRVVT)

dRVVT是用于检测狼疮抗凝物的凝血试验，而抗凝药物一直以来被视为导致dRVVT结果不可靠的临床因素。研究显示，dRVVT对NOACs有浓度依赖性影响[43]，即使NOACs血药浓度处于谷值水平，dRVVT检测中假阳性发生率也高得惊人[44]。

临床实践发现，不同NOACs对dRVVT试验的影响存在显著差异，如dRVVT对血药浓度较低的达比加群非常敏感，dRVVT标准化比值呈剂量依赖性，且与出血风险相关[43]；此外，dRVVT与anti-FⅩa测定血浆浓度有一定关联性[45]，其中<100 ng/mL的利伐沙班和<70 ng/mL的阿哌沙班对dRVVT确认试验有较弱的影响[43]。Ratzinger等[44]研究显示，与不含NOACs的血浆标本比较，达比加群血浆浓度>12.5 ng/mL时，即可造成dRVVT明显延长，使dRVVT确认实验假阳性率达43.3%；利伐沙班血浆浓度>7.5 ng/mL时，会全面影响dRVVT的筛选试验和确认试验，其中30.0%的确认试验显示假阳性；阿哌沙班血浆浓度>18.75 ng/mL时，确认试验明显延长，假阳性率达20.7%，与其他NOACs相比，阿哌沙班对dRVVT比值的影响与药物剂量无依赖性。Favaloro等[46]对7 170例结果进行了分析，发现几乎所有NOACs都可导致dRVVT筛选试验和确认试验的延长，其中利伐沙班对筛选试验的影响大于确认试验，导致dRVVT比值较高(假阳性)，而阿哌沙班对确认试验的影响大于筛选试验，甚至可能导致dRVVT比值较低(假阴性)。Reda等[47]研究显示，dRVVT标准化比值与利伐沙班相关，与阿哌沙班血浆水平无关。总体而言，基于dRVVT对较低水平的NOACs有较高的敏感性，未来有可能成为急诊室或在紧急情况下[45]快速评估患者潜在出血风险的有效方法(尤其是利伐沙班和达比加群酯)。

8 结语

随着NOACs在临床上应用范围日益广泛，其在复杂临床情况下的药物代谢以及药效学不稳定现象频繁发生，进而引发各种出血和血栓复发等不良事件，人们开始意识到，构建有效的实验室评估体系是提高抗凝治疗安全性和有效性的关键。由于质谱技术尚不能普及，基于功能试验的检测手段仍将长期作为监测NOACs的主要方法，但目前仍有一些亟待解决问题。首先，基于患者个体特征、合并症与治疗因素叠加现象，需进一步细化检测指征分类，以提高监测的针对性和结果分析的可靠性；其次，根据本机构NOACs的类型和剂型，应完善实验方法学标准化体系(尤其是校准曲线)，避免错误使用试验(如将低分子肝素的anti-FⅩa监测利伐沙班，或将利伐沙班的anti-FⅩa监测阿哌沙班)；再次，针对不同临床问题，构建对应的临界值评价体系，以指导医生针对性调整药物。随着人类社会预期寿命的不断延长，血栓性疾病日益成为主要的健康威胁，而抗凝治疗则是血栓防治的基石，预期在多学科联合的基础上，未来抗凝监测领域将会有更多的回顾性和前瞻性队列研究、随机对照试验以及系统评价和荟萃分析，为临床实践提供更为坚实的循证依据。