自噬在兔部分损伤前交叉韧带和内侧副韧带中的差异*

谷慧凝 韩银河 张明正 李 彬 温 昱△

（中国医科大学，1 基础医学院组织胚胎学教研室，2 附属盛京医院关节外科与运动医学科，沈阳 110122）

前交叉韧带损伤引起复发性膝关节不稳定，导致半月板撕裂、关节软骨退变等其他膝关节结构继发性损伤[1]。由于前交叉韧带损伤后的自愈能力非常差，目前手术修复仍为其主要治疗手段，但术后的前交叉韧带仍不能较好地恢复其生物学功能，甚至会出现关节僵硬、骨关节炎等术后并发症，而内侧副韧带有相对更好的自愈能力，在某些情况下可以自我愈合，并完全恢复其功能[2-3]。自噬是存在于真核细胞中由溶酶体介导的对细胞内生物大分子和受损细胞器进行降解和回收的过程，对维持细胞的存活和稳态有重要作用。研究表明，自噬可通过直接或间接方式参与组织损伤修复，在血管新生、伤口愈合、促进表皮和真皮再生等过程中具有重要作用[4-5]，但目前自噬在前交叉韧带、内侧副韧带损伤后的表达尚未可知，自噬是否可以作为两者愈合能力差异的可能解释也没有详细探讨。因此，本实验拟通过建立兔前交叉韧带、内侧副韧带部分损伤模型，观察损伤后不同时间点两者之间自噬的表达差异，以探索前交叉韧带损伤后内源性修复障碍可能的分子机制，为进一步探索促进前交叉韧带损伤内源性修复的有效手段提供新思路。

1 材料和方法

1.1 实验动物和损伤模型建立、分组和取材

3月龄健康雄性新西兰大白兔18 只，体质量（2 500±200） g，由中国医科大学实验动物部提供。实验动物饲养于中国医科大学实验动物部，室内保持光照、黑暗 12 h 昼夜节律，室温 22 ℃± 1℃，相对湿度 50% ～60%，自由饮食饮水。适应性喂养1 周后，随机选取3 只作为对照组，不作处理。其余15 只兔制备随机分为5 组 （n=3），由耳缘静脉注射3%（1 mL/kg）戊巴比妥钠麻醉，固定动物，手术部位剃毛，消毒，铺无菌孔巾后，取兔膝关节偏内侧行纵向切口，切口长约1.5 cm，逐层切开皮肤、钝性分离皮下组织及关节囊，充分暴露前交叉韧带与内侧副韧带，用20 mL 针头在前交叉韧带近股骨端扎孔，接着同样在内侧副韧带近股骨端1/3 处刺破韧带，制造损伤后缝合包扎。兔双侧前交叉韧带、内侧副韧带均制造损伤。术后肌肉注射头孢曲松钠注射液抗感染。韧带的穿刺均由1 人操作，以保证穿刺力度、损伤部位及程度的一致性。各组分别在造模后3 d、1 周、2 周、4 周、6 周取材。取材前，将兔经耳缘静脉空气栓塞处死，解剖并分离兔前交叉韧带、内侧副韧带，将其放在干净的滤纸上均分为 3 份，一份置 2.5%戊二醛中固定，待做透射电镜检测； 另一份置 4% 多聚甲醛中固定，以备冰冻切片及H-E 染色；第3 份置于冰上提取蛋白及RNA，以备免疫印迹及 RT-PCR 检测。

1.2 主要试剂

第一抗体兔多克隆抗体Beclin 1、LC3、p62，第二抗体山羊抗小鼠IgG，山羊抗兔IgG 均购自Proteintech（Chicago，USA）；小鼠单克隆抗体β-actin、抗体稀释液购自Beyotime（中国上海）；Beclin 1、ATG-5 引物购自Invitrogen （Carlsbad，California，USA）；逆转录试剂盒购自TaKaRa Bio。

1.3 H-E 染色观察前交叉韧带、内侧副韧带组织结构

将各组经4%多聚甲醛固定的前交叉韧带、内侧副韧带取出，PBS 冲洗后制备10 μm 冰冻切片，并进行 H-E 染色。光学显微镜下观察各组兔前交叉韧带、内侧副韧带组织形态学变化，并用图像采集系统获取所需图片，进行形态学分析。

1.4 透射电镜观察前交叉韧带、内侧副韧带组织结构

取经2.5%戊二醛固定的前交叉韧带、内侧副韧带，使用 pH 7.2 的磷酸缓冲盐溶液漂洗3 次，1%锇酸固定2 h，4℃下梯度乙醇（50% 、70% 、90%、100%） 脱水； 置换（环氧丙烷，环氧丙烷和树脂 1∶1 混合液，环氧丙烷和树脂1∶4 混合液，纯树脂）； 环氧树脂包埋后制作半薄切片；超薄切片机切片后铜网捞片，3% 醋酸双氧铀-枸橼酸铅双染色法染色。待样品干燥后，透射电镜观察受损韧带组织超微结构变化，并进行分析。

1.5 免疫印迹检测自噬相关蛋白表达水平

取适量兔前交叉韧带、内侧副韧带组织，加入裂解液匀浆，离心取上清，BCA 法测定蛋白质浓度，在一定量上清液中加入缓冲液后100℃金属浴5 min，置于冰上待上样。SDS-PAGE 分离蛋白质，电转移至 PVDF 膜，置摇床上用 5% 脱脂奶粉封闭1 h，TBST 洗膜，轻轻冲洗PVDF 膜，将其置一抗稀释液中 4℃ 摇床上孵育过夜。次日用 TBST洗膜，加对应的二抗稀释液置摇床上室温孵育1 h，用 TBST 洗膜。将 ECL 化学发光液均匀涂于膜上，置发光机中曝光显影成像，以 Image J 软件分析扫描图像，以目的基因条带与内参条带的灰度值比作为相对蛋白的表达量。

1.6 RT-PCR 检测自噬相关基因mRNA 表达水平

取适量兔前交叉韧带、内侧副韧带组织，按照1 mL/100 mg加入TRIzol试剂匀浆，依次加氯仿，振荡，离心取上清；加异丙醇，振荡，离心弃上清，75% 乙醇洗涤，室温晾干；加适量DEPC水溶解RNA，并弹匀离心，随后测定RNA浓度。根据逆转录体系调整RNA浓度，并计算逆转录所需上样量，而后逆转录合成 cDNA。 按TB Green Premix Ex TaqⅡ （Tli RNaseH Plus）配置反应混合物后，并进行RT-PCR扩增，反应条件：预变性（95 ℃、30 s）；扩增（95 ℃、5 s，60 ℃、30 s）；溶解曲线（95 ℃、5 s，60 ℃、1 min，95 ℃）；降温（50 ℃、30 s）。ATG-5正向引物序列5'-TG CTTTCCTCCACTGTCGTC-3'，反向引物序列5'-T CGAGTG-GCACACATTTCCA-3'；Beclin 1 正向引物序5'-CCTCAAGTGGGGTCTTGCTT-3'，反向引物序列5'-AACTGTGACAAGGGTCGGTG-3'；GAPDH正向引物序列5'-GG-GAAGCTGGTCATC AACGG-3'，反向引物序列5'-AACTGT-GACAA GGGTCGG-TG-3'。引物由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司设计并合成。通过PCR仪器自带软件获取扩增产物的Ct值，采用公式2-△△Ct计算mRNA相对表达量。每个样品设置3个复孔，取均值。

1.7 统计学处理

采用Graphpad Prism 8统计软件进行统计学处理。实验数据用±s表示,损伤后不同时间点各组间差异采用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较,各组内前交叉韧带和内侧副韧带差异以LSD法进行两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组前交叉韧带、内侧副韧带损伤后形态学变化

H-E 染色（图1，见封二）显示，正常对照组前交叉韧带、内侧副韧带纤维束呈纵向排列，成纤维细胞形态规则呈梭形，分布于韧带的胶原纤维之间。在前交叉韧带、内侧副韧带损伤后不同时间点，组织之间开始出现不同程度的腔隙，成纤维细胞及其胶原纤维排列不规则，且前交叉韧带、内侧副韧带均未出现明显的愈合趋势。各组损伤后不同时期细胞内均观察到自噬小体的存在，胞质内含有丰富的粗面内质网（RER）和少量细胞器（图2，见封二）。

图1 H-E 染色观察各组韧带损伤部位形态学变化，标尺=300 μm

2.2 前交叉韧带、内侧副韧带损伤后自噬相关蛋白Beclin 1、LC3、p62 的表达变化

在前交叉韧带、内侧副韧带部分损伤后3 d、1周、2周、4周、6周的过程中，自噬相关蛋白Beclin 1、LC3-Ⅱ/Ⅰ与 p62 的表达总体呈现先升高后降低的变化趋势（图3）。损伤后3 d，前交叉韧带和内侧副韧带中Beclin 1、LC3-Ⅱ/Ⅰ与 p62 的表达均较正常对照组升高（P＜0.01），并达到峰值，此后逐渐降低。损伤后1 周，前交叉韧带中Beclin 1、LC3-Ⅱ/Ⅰ与p62 仍高于正常对照组水平（P＜0.01），此时内侧副韧带中各蛋白表达与正常对照组差异无统计学意义。损伤后2周，前交叉韧带中Beclin 1、p62的表达恢复至正常水平，LC3-Ⅱ/Ⅰ仍为高表达状态（P＜0.01）。损伤后4周，前交叉韧带中各蛋白表达恢复至正常水平，内侧副韧带中p62表达低于正常对照组（P＜0.05）。损伤后6周，内侧副韧带中各蛋白表达水平明显低于正常对照组（P＜0.05，P＜0.01）。此外，损伤后各时间点前交叉韧带中各蛋白相较于正常对照组的高表达始终比内侧副韧带更为显著。

图3 各组自噬相关蛋白Beclin 1、LC3 Ⅱ/Ⅰ、p62 蛋白表达水平变化

2.3 前交叉韧带、内侧副韧带损伤后自噬相关基因ATG-5、Beclin 1 mRNA 表达的变化

在前交叉韧带、内侧副韧带部分损伤后3 d、1 周、2 周、4 周、6 周的过程中，自噬相关基因Beclin 1、ATG-5 mRNA 的表达总体呈现先升高后降低的变化趋势（图4）。损伤后3 d 至6 周内，与正常对照组相比，前交叉韧带中Beclin 1、ATG-5 mRNA 始终处于高表达状态（P＜0.01），在1 周时达到峰值，且在损伤后3 d、1周、4周、6周4个时间点前交叉韧带中Beclin 1、ATG-5 mRNA的表达始终高于内侧副韧带；而在内侧副韧带中，Beclin 1、ATG-5 mRNA高表达的峰值出现在2周时，且此时内侧副韧带中的高表达较前交叉韧带更为显著（P＜0.01），此后逐渐降低，在损伤后4周、6周2个时间点，Beclin 1、ATG-5 mRNA在内侧副韧带中的表达与正常对照组相比差异无统计学意义。

图4 各组自噬相关基因Beclin 1（A）、ATG-5 mRNA（B）表达水平变化

3 讨论

90%的膝关节韧带损伤涉及前交叉韧带或内侧副韧带[6]。但与内侧副韧带相比，前交叉韧带损伤后的自愈反应极差，手术效果不佳[2-3]，其内源性修复障碍已成为现代运动医学亟需解决的难题。近年来，学者从血供、干细胞性及成纤维细胞的蛋白表达等方面对此提出了多种解释[2，6-9]，但仍未阐明具体分子机制。研究表明，自噬可通过直接或间接的方式在血管新生、伤口愈合、促进表皮和真皮再生等过程中发挥重要作用[4-5]，自噬的调节作为一种组织损伤修复的方法具有相当大的潜力。

本研究结果显示，在前交叉韧带、内侧副韧带损伤后3 d、1 周、2 周、4 周、6 周的过程中，自噬的活性随时间整体呈现先升高后降低的变化趋势，提示自噬可能参与韧带损伤后修复的过程。自噬的作用具有两面性，适量的自噬激活对细胞有一定的保护作用，但过多的自噬激活或导致细胞死亡途径的激活[10]，从而进一步导致细胞的死亡。RT-PCR和免疫印迹检测结果显示，损伤后的前交叉韧带中自噬的高表达更为显著，这可能与内侧副韧带拥有更好的血供能力[7]及前交叉韧带成纤维细胞对炎症反应更为敏感[11]有关，而这种更强的自噬活性或导致其相较于内侧副韧带更多的细胞死亡，从而导致其内源性修复障碍。相反，内侧副韧带后期表现出的自噬相关蛋白表达的抑制，可能更利于韧带的修复。此外，本研究结果显示，p62 与Beclin 1、LC3 Ⅱ/Ⅰ的表达并未呈现完全相反的变化，可能与自噬小体的累积及自噬通常被阻滞有关[12]。自噬通常由自噬小体形成和自噬降解两部分组成，自噬降解相关蛋白p62 的累积表明自噬的清除不足，有缺陷或失控的自噬可能通过选择性降解细胞成分而导致细胞死亡[10]。而前交叉韧带中更为明显的p62 累积在某种程度上可能进一步造成了细胞的过度死亡，这或许也导致了前交叉韧带内源性修复障碍。

综上所述，自噬的表达在前交叉韧带、内侧副韧带损伤后存在明显差异，前交叉韧带损伤后自噬的过度激活可能导致其内源性修复障碍，这为探索前交叉韧带损伤后内源性修复障碍可能的分子机制提供了依据，也为研究促进前交叉韧带损伤内源性修复的有效手段提供了新思路。