纳米木聚糖处理对木腐菌的抑菌效果研究∗

赵 艳 程泽琦 罗来朋 庞久寅

（北华大学，吉林省吉林市 132013）

木聚糖具有抑菌性强、绿色无毒等特点［1-3］，是一种天然生物防腐剂，主要存在于自然界植物细胞的半纤维素中，占植物细胞干重的35%，是由木糖经β-1,4糖苷件连接而成的高分子物质。通过前期研究发现，纳米木聚糖的粒径较小，更容易渗入到木材孔隙中，抗流失性好，在木材中可以更好地分散和渗透，在常压下浸泡木材就能获得较好的防腐效果［4-6］。相比传统木材防腐剂，其原料范围广，可从玉米芯、麸皮、甘蔗渣、玉米秸秆、花生壳、棉籽壳等农林废弃物提取获得，无毒无害，并可自然降解，不会对人体及环境产生不利影响。目前，木聚糖主要应用于制药、污水处理、造纸助剂、热塑性材料、食品添加剂等领域，在木质材料防腐中的应用还鲜有研究［7-8］。本文主要以彩绒革盖菌和密粘褶菌为供试菌种，从呼吸作用、电导率、蛋白质渗出率等方面入手，研究纳米木聚糖对木腐菌生理生化机制的影响，探讨其对木腐菌的抑菌效果，为开发新型高效木材天然生物防腐剂提供参考［9-13］。

1 材料与方法

1.1 材料

麦芽糖马铃薯培养基；考马斯亮蓝试剂盒，分析纯，Solarbio；BSA标准蛋白（5 mg/mL），分析纯，考马斯亮蓝试剂盒中配备；葡萄糖，食品级，汕头市未来食品有限公司；乙醇、硫酸、氢氧化钠，分析纯，天津市大茂化学试剂厂；彩绒革盖菌（Coriolus versicolor）、密粘褶菌（Gloeophyllum trabeum）,阿坝州分部研究所。

1.2 设备

TP200精密微差压差计，北京昶信科技发展有限公司；BBS-V800超净工作台，山东博科生物产业有限公司；电热恒温浴锅，电动搅拌器，ET-60恒温孵育器，金坛市富华仪器有限公司；TG328A分析天平，上海天平仪器厂；高速离心机，立式蒸汽灭菌器，细菌培养箱，安徽中科中佳科学仪器有限公司；3173R电导率仪，南京海纳仪器设备有限公司；LP-5118多功能酶标分析仪，山东桑泽仪器仪表有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 木聚糖提取工艺

选择干燥、无虫蛀、无霉变的玉米芯，先用锤子敲碎成小块，然后置于粉碎机中粉碎，过40 目筛，备用［8-9］。准确称取玉米芯 10 g，在电炉上煮沸，4 h后滤去多余水分后装入三口瓶中，加入 250 mL 浓度为25%的NaOH溶液，94 ℃搅拌浸提 3 h，离心，取上清液、过滤，并向过滤液体中加入体积比为1∶3 的95%的乙醇，滤去液体，并利用高速离心机在8 000 r/min下离心10 min即可得到木聚糖粗制品［14-16］。

1.3.2 纳米木聚糖提取工艺

将1 g木聚糖加入100 mL 的2% NaOH溶液，在60 ℃温度下溶解，用稀酸调节pH值至5.5，加入3倍体积的乙醇进行沉淀，抽虑后进行冷冻干燥，制得纳米木聚糖。

1.3.3 麦芽糖马铃薯培养基的配制

称取100 g新鲜马铃薯，去皮，切成小块，放在500 mL细口锥形瓶内，加水后煮沸。待煮沸30 min后，滤去土豆块，加水补足至300 mL，并向其中加入6 g葡萄糖，即为麦芽糖马铃薯培养基。

1.3.4 纳米木聚糖对木腐菌有氧呼吸试验

高浓度的氢氧化钠溶液可以吸收木腐菌有氧呼吸所产生的CO2，通过精密微差压差计测定系统中的气压变化来判断木腐菌的呼吸量［17-18］。试验所用装置如图1所示。

图1 木腐菌有氧呼吸测定装置Fig.1 Device of respiration determination

在超净工作台中进行试验，首先取容量为100 mL的三口瓶，用无菌枪头向其中加入20 mL含纳米木聚糖的麦芽糖培养基，纳米木聚糖的质量分数分别为1%、5%、10%。然后向锥形瓶内加入2 g菌丝，轻轻打散。将10% NaOH浸湿的纱布加塞在瓶口处，并在瓶塞传感器的连接处和瓶塞与瓶身连接处均涂抹凡士林，以确保气密性检测无问题，将连接好的装置从超净工作台中取出，放入28 ℃恒温孵育箱中，在锥形瓶底部放置磁力搅拌器，开启磁力搅拌器轻轻搅拌。每隔10 min，用精密微差压差计记录气压变化值，测定时长为120 min。

1.3.5 纳米木聚糖对木腐菌胞内蛋白渗出量试验

考马斯亮蓝法是一种测定蛋白质浓度的方法。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，吸光值为488 nm，与蛋白质结合后会变为青色，吸光值为595 nm。吸光值的大小与蛋白质浓度成正比，具体浓度可通过标准蛋白所绘制的标准曲线计算获得［19-21］。

首先将5 mg/mL的标准蛋白分别配制为0、20、40、60、80、100、160、200 µg/mL的标准蛋白溶液，置于4 ℃冰箱中保存备用。然后称取2种木腐菌各1 g，并用1%、2%、5%、8%、10%不同质量分数的纳米木聚糖20 mL处理24 h。

试验用96孔板进行，每项做3个副孔。在分配并标记好96孔板后，用移液枪取20 µL蒸馏水和180 µL考马斯亮蓝，加入到96孔板内，记为对照空白孔。用移液枪分别取20 µL标准蛋白溶液（0、20、40、60、80、100、160、200 µg/mL）和180 µL考马斯亮蓝，加入到96孔板内，记为标准蛋白孔；用移液枪分别取20 µL不同质量分数纳米木聚糖处理过的木腐菌液和180 µL考马斯亮蓝，加入到96孔板内，记为测定孔。

全部孔加完后，在室温下静置10 min后，用酶标仪在595 nm下测定各个孔的吸光度，记录并计算蛋白浓度。用标准蛋白孔的吸光值制作标准曲线，以确定其余孔中的蛋白质浓度，标准曲线如图2所示。

图2 BSA蛋白标准曲线Fig.2 Standard curve of BSA protein

1.3.6 纳米木聚糖对木腐菌细胞通透性试验

通过测定溶液电导率的变化确定纳米木聚糖对木腐菌细胞膜通透性的影响，电导率增加越快，细胞膜通透性越大［22-24］。

称取彩绒革盖菌和密粘褶菌菌丝各3 g，分别放入1%、5%、10%不同质量分数的纳米木聚糖中，使用电导率仪测定其电导率变化，并用含同量吐温-80的蒸馏水作为对照组。根据电导率变化判断纳米木聚糖对木腐菌菌丝细胞膜通透性的影响［25］。校正电导率=实际电导率-对照。

2 结果与分析

2.1 纳米木聚糖对木腐菌有氧呼吸的影响

根据木腐菌有氧呼吸程度，分析研究纳米木聚糖对2种木腐菌新陈代谢的影响。浸有10% NaOH的纱布条可以吸收木腐菌呼出的CO2，从而使密闭装置中的气压略为下降。通过精密微差压差计观测密闭装置的气压变化，结果如图3所示。

图3 纳米木聚糖对木腐菌有氧呼吸的影响Fig.3 Effects of nano-xylan on aerobic respiration of wood-rot fungi

从图3中可以看出，纳米木聚糖对白腐菌彩绒革盖菌的有氧呼吸具有一定的抑制作用。随着时间的增加，精密微差压差计测得的值逐渐变小，并趋向于稳定，说明彩绒革盖菌的有氧呼吸越来越弱。随着纳米木聚糖质量分数的增加，对彩绒革盖菌的有氧呼吸抑制性越强，90 min时，彩绒革盖菌的呼吸作用趋于稳定。对于褐腐菌密粘褶菌的有氧呼吸抑制性则较弱，当时间到达120 min时，密粘褶菌的气压仍处于下降趋势，并未趋于平稳，这说明密粘褶菌的有氧呼吸依旧在继续。

试验表明，纳米木聚糖对彩绒革盖菌的有氧呼吸有抑制作用，随着纳米木聚糖质量分数额提升，对彩绒革盖菌的有氧呼吸抑制性越强。但纳米木聚糖对密粘褶菌的有氧呼吸抑制性有限。

2.2 纳米木聚糖对木腐菌胞内蛋白渗出量的影响

从图4可以看出，随着纳米木聚糖质量分数的提升，白腐菌彩绒革盖菌和褐腐菌密粘褶菌的蛋白渗出量均呈上升趋势，纳米木聚糖可以作用于木腐菌的细胞膜，使细胞膜的通透性增加。但相较而言，彩绒革盖菌的蛋白渗出量要多于密粘褶菌。

图4 纳米木聚糖对木腐菌蛋白渗出量的影响Fig.4 Effect of nano xylan on protein exudation of wood rot fungus

2.3 纳米木聚糖对木腐菌细胞通透性的影响

由图5可知，与对照样相比，纳米木聚糖能够提升彩绒革盖菌的菌丝电导率，且质量分数越高电导率也越高，在10 min时基本趋于稳定。这说明纳米木聚糖可以增加彩绒革盖菌的通透性。如图6所示，与对照样相比，纳米木聚糖使密粘褶菌的电导率上升，并随着纳米木聚糖质量分数的增加，密粘褶菌的电导率增加，总体上升幅度较小。这说明纳米木聚糖可以增加密粘褶菌的通透性，但是效果有限。

图5 纳米木聚糖对彩绒革盖菌电导率的影响Fig.5 The effect of nanoxylan on the cells conductivityof Coriolus versicolor

图6 纳米木聚糖对密粘褶菌电导率的影响Fig.6 The effect of nanoxylan on the cells conductivity of Gloeophyllum trabeum

3 结论

1）纳米木聚糖对白腐菌彩绒革盖菌的有氧呼吸有抑制作用，随着纳米木聚糖质量分数的提升，对彩绒革盖菌有氧呼吸抑制性就越强，在90 min时，彩绒革盖菌的呼吸作用趋于稳定。但纳米木聚糖对褐腐菌密粘褶菌的有氧呼吸抑制性有限，在120 min时，其有氧呼吸依旧在继续。

2）通过考马斯亮蓝法测定发现，纳米木聚糖处理可以增加木腐菌蛋白质渗出率，彩绒革盖菌的蛋白渗出率要大于密粘褶菌。

3）纳米木聚糖处理木腐菌后，会增加木腐菌所在溶液的电导率，这说明纳米木聚糖可以增大木腐菌细胞膜的通透率，使细胞内电解质外泄。

4）纳米木聚糖对白腐菌彩绒革盖菌的抑制性要强于褐腐菌密粘褶菌。