化妆品中苯氧乙醇和辛酰羟肟酸含量的测定方法

朱礼坪，黄泽彬，李 东，黄小茉,3*，谢小保,3

1.广东迪美生物技术有限公司，广东广州 510663；2.广东省防霉抗菌工程技术研究中心，广东广州 510070；3.广东省微生物研究所省部共建华南应用微生物国家重点实验室，广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东广州 510070

苯氧乙醇从20世纪80年代中期开始广泛应用于化妆品配方中，是一种高沸点、低挥发性溶剂，还是一种高效、低致敏、广谱的杀菌防腐剂。苯氧乙醇与常见化妆品防腐剂或抗氧剂复配使用可有效地抑制或杀灭铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、白假丝酵母菌、黑曲霉和大肠杆菌等[1]。羟肟酸类化合物是一种对金属离子具有高效选择性的螯合剂，而辛酰羟肟酸在化妆品中可与原料或水中有害的金属离子络合，能抑制这些金属离子的活性，防止对产品或原料造成浑浊、氧化、变色等不良影响，有利于延长化妆品原料或成品的保质期[2]。近年来，由于辛酰羟肟酸在众多国家中安全性及其在全球化妆品法规管理中除澳大利亚NICNAS专门对辛酰羟肟酸在最大使用浓度不超过0.3%的情况外，其他国家对它的使用并无使用限制说明[3-5]。专利号CN102920612A[6]报道，苯氧乙醇与辛酰羟肟酸复配时更可达广谱抑菌杀菌效果。

《化妆品安全技术规范[S]北京:中国标准出版社，2015年第4版》中苯氧乙醇的含量测定方法为：流动相：0.05 mol/L磷酸二氢钠+甲醇+乙腈(50+35+15)，加氯化十六烷三甲胺至最终浓度为0.002 mol/L，并用磷酸调pH至3.5，该方法需要用到缓冲盐使其操作复杂、损耗色谱柱使色谱柱寿命降低且检测耗时长。现如今对于辛酰羟肟酸的检测方法中，广州质量监督检测研究院莫庭源等研究报道的方法为：甲醇+0.1%甲酸水溶液(55+45体积比)，该方法需要使用缓冲盐同理不推荐[7]。还有广州立白企业集团有限公司、广州芭薇生物科技有限公司对化妆品中辛酰羟肟酸含量进行了分析，方法中分别以乙腈∶水=55∶45(体积比)、乙腈∶水=45∶55(体积比)进行检测分析[8、9]。经验证，该方法在化妆品中辛酰羟肟酸出峰时间会与苯氧乙醇出峰时间完全一致或有重叠峰而造成干扰，会影响目标物质的定性和定量。因此，开发不使用缓冲盐，可以减少其对色谱柱的损耗且检测效率提高，并使化妆品中辛酰羟肟酸和苯氧乙醇峰型分离度高，简单可靠，线性范围宽，抗干扰能力强，具有良好的精确度和精密度的检测方法具有重要市场应用价值。

本方法选用甲醇/乙腈/水为流动相，拟建立起同时精确检测化妆品中苯氧乙醇和辛酰羟肟酸的含量，并对其线性范围、精确度、回收率和两种成分的抑菌防腐性能作分析研究。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

仪器：HPLC-20A高效液相色谱仪、SPD-M20A 230V型光电二极管阵列可见光检测器(日本岛津公司)；KQ-100DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);XW-80A旋涡混合器(上海淇特分析仪器有限公司)；TG16-WS台式高速离心机(湖南湘实验室仪器开发有限公司)；超纯水机；ME204E/02型万分之一电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)。

试剂：乙腈、甲醇，色谱纯，上海安谱广州分公司；苯氧乙醇、辛酰羟肟酸原料(市售)。

1.2 仪器工作条件

岛津InertSustain C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；柱温40 ℃；流动相∶甲醇∶乙腈∶水=35∶15∶50，流速：1 ml/min；检测器：二极管阵列检测器；检测波长230 nm；柱温：40 ℃。

1.3 标准曲线的制作

分别准确称量取苯氧乙醇、辛酰羟肟酸，用甲醇溶解，定容到100 mL容量瓶。配置成浓度为1.0×10-3mol/L的储备液，放置于4 ℃冰箱中保存。将苯氧乙醇和辛酰羟肟酸储备液用HPLC级甲醇稀释，并配制成含有苯氧乙醇和辛酰羟肟酸的标准溶液。苯氧乙醇浓度分别为1.0×10-5mol/L、5.0×10-5mol/L、1.0×10-4mol/L、5.0×10-4mol/L和1.0×10-3mol/L;辛酰羟肟酸浓度分别为5.0×10-5mol/L、1.0×10-4mol/L、5.0×10-4mol/L、1.0×10-3mol/L和5.0×10-2mol/L的标准溶液。

1.4 提取

水样、面膜液、护理液、膏霜试验:称取0.5 g(精确到0.001 g)试验置于15 mL尖底离心管中，用甲醇定容至10 mL，于旋涡振荡器上振荡均匀后，超声提取40 min,继续旋涡振荡器上振荡均匀后于离心机以10 000 r/min离心10 min。上机分析前使用0.22 μm有机系滤膜过滤，滤液作为待测样液备用。

1.5 样品微生物防腐性能实验测试

分别在面膜液、护理液、膏霜三种化妆品中添加1 000 mg/kg苯氧乙醇和500 mg/kg辛酰羟肟酸，然后按广东省日化商会团体标准T/GDDC 010-2019《化妆品防腐挑战测试方法》测试产品的防腐功效。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

苯氧乙醇和辛酰羟肟酸混合标准溶液的色谱图见图1，由图可见，苯氧乙醇的峰保留时间于5.0 min左右，而辛酰羟肟酸的峰保留时间于6.3 min左右，两原料的出峰时间相差较大，无出现重叠干扰。

图1 苯氧乙醇和辛酰羟肟酸的色谱图

2.2 检测波长与方式选择

取配置好的苯氧乙醇和辛酰羟肟酸混合标准溶液在190 nm～500 nm检测波长范围内进行全波长扫描，测定苯氧乙醇和辛酰羟肟酸混合标准溶液的紫外-可见吸收光谱(如图2和图3所示)，苯氧乙醇、辛酰羟肟酸分别在215 nm、200 nm附近有强吸收峰，经多次实验分析采用210 nm可以获得较高灵敏度，干扰较少。因此选择检测波长为210 nm。

图2 苯氧乙醇光谱图

图3 辛酰羟肟酸光谱图

2.3 流动相选择

分别考察了甲醇/水、乙腈/水、甲醇/乙腈/水溶液等多种流动相中苯氧乙醇和辛酰羟肟酸的分离情况。结果表明，采用甲醇/水为流动相，只有苯氧乙醇出峰；选择乙腈/水溶液为流动相时，其体积比不同分离度差别较大，在乙腈流动相大于50%时，苯氧乙醇和辛酰羟肟酸峰型完全重叠，小于50%时，分离度会高一点，但是有重叠峰造成干扰,因此,乙腈/水流动相影响目标物质的定性和定量；使用甲醇/乙腈/水的流动相，目标物质分离效果好且获得最佳UV响应，最佳分离条件为甲醇∶乙腈∶水=35∶15∶50等梯度洗脱。

2.4 检出限与定量限

取一定浓度的混合对照品溶液用液相色谱仪进行测试，记录色谱图，根据其峰信号，将信噪比为3∶1时的进样量为检出限，测得苯氧乙醇的检出限为5 mg/L、辛酰羟肟酸的检出限为10 mg/L。信噪比为10∶1时的进样量为检出限，测得苯氧乙醇的定量限为15 mg/L、辛酰羟肟酸的检出限为50 mg/L。

2.5 线性范围考察

各梯度标准溶液用0.22 μm有机滤膜过滤后按“1.2”项下色谱条件进样分析,每个浓度进样3次,取3次平均值,所得色谱峰对应的浓度和对应的峰面积绘制标准曲线,得回归方程,如表1所示。结果表明,苯氧乙醇和辛酰羟肟酸线性良好，相关系数均大于0.999 0。

表1 苯氧乙醇和辛酰羟肟酸的线性范围、线性方程、相关系数、检出限

2.6 重复性试验

精密称取面膜液、膏霜样品各6份，每份约0.5g，按“1.4.1”项下操作,照“2.1”色谱条件下进样分析,记录峰面积并计算含量,结果面膜液和膏霜中苯氧乙醇和辛酰羟肟酸平均含量分别为0.1%,0.05%，RSD分别为0.23%，0.48%(n=6)，结果表明方法的重复性良好。

2.7 稳定性试验

分别将待测样品溶液在室温下放置，分别在白天、夜间和第二天白天按照“2.1”色谱条件下进样分析,记录峰面积并计算含量,计算RSD。结果显示,RSD均小于0.05%(n=6),表明两种防腐剂在室温下放置24 h的稳定性好。

2.8 回收率和精密度试验

取液态水基、面膜液、护理液类、膏霜类4种空白基质为加标基质，按“2.1”色谱条件下进行低、中、高3个加标水平的回收率试验，结果显示，苯氧乙醇的3个加标水平回收率为97.2%～104.4%,辛酰羟肟酸的3个加标水平回收率为98.2%～104.5%(n=6),表明本方法具有良好的准确度和精密度，可满足苯氧乙醇和辛酰羟肟酸含量测定的要求(见表2)。

表2 辛酰羟肟酸、苯氧乙醇的回收率和精密度(n=6)测定结果

2.9 实际样品检测

随机抽取市售的水剂类、乳液类、膏霜类化妆品各10份,应用本文建立的方法进行检测，以标准曲线法计算含量，结果显示，部分苯氧乙醇添加量为0.1%～0.3%，辛酰羟肟酸添加量为0.03%～0.08%。选取乳液类化妆品样品色谱图如图4。

图4 乳液类化妆品样品色谱图

2.10 样品的抑菌防腐性能分析

含1 000 mg/kg苯氧乙醇和500 mg/kg辛酰羟肟酸的面膜液、护理液、膏霜对微生物防腐挑战实验测试结果如图5所示，在106CFU/g～107CFU/g高浓度菌种中加入样品7 d内，其菌落总数均降低至<10 CFU/g，而通过测试辛酰羟肟酸的最低抑菌浓度(MIC)，单独辛酰羟肟酸对各常见菌种最低抑菌浓度均于800 mg/kg ～1 000 mg/kg，在化妆品中做防腐使用成本较高，而单使用苯氧乙醇作防腐剂不仅添加量大，且气味大，因此，苯氧乙醇和辛酰羟肟酸复配作化妆品防腐剂是具有较高性价比、满足市场需求的实用方案，而本文研究的检测方法可以精确、快速同时检测苯氧乙醇和辛酰羟肟酸的含量，且避免两成分在检测中相互干扰，为市场化妆品中防腐剂成分含量检测起重要作用。

图5 面膜液、护理液、膏霜样品微生物防腐挑战测试结果

3 结论

本文通过研究流动相组成对两种原料原料色谱保留性能的影响，克服峰重叠干扰问题，采用甲醇-乙腈-水溶液为流动相，反相液相色谱法检测化妆品中的苯氧乙醇和辛酰羟肟酸的含量，检测下限分别为5mg/L和20 mg/L。方法的回收率为97.2%～104.5%，RSD为1.5%～4.1%，说明该方法色谱峰分离度高且对称，检测方便快捷，结果精密度高和重现性好等优点。此外，本文提供化妆品中苯氧乙醇和辛酰羟肟酸复配的抑菌防腐性能活性含量分析结果，为满足市场需求的使用提供参考方案。