高脂饮食致非酒精性脂肪性肝病大鼠小肠、肝脏中NOD 样受体蛋白3及相关炎症因子的表达*

夏恩蕊，张素妍，田格格，李 浩，杜玉锐，张顺贞

（云南中医药大学中药学院，云南 昆明 650500）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种与胰岛素抵抗和遗传易感密切相关的代谢应激性肝损伤，疾病谱包括非酒精性肝脂肪变、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）、肝硬化和肝细胞癌[1]。随着肥胖发病率的增加，NAFLD 已成为全球关注的主要健康问题之一。NLRP3 是一种模式识别受体（PRRs），隶属于NOD 样受体家族（NOD-like receptor，NLRs），是NLRP3 炎症小体的组成部件之一[2]。在病原体相关分子模式（PAMPs）或损伤相关分子模式（DAMPs）的刺激下，NLRP3 可出现上调，启动炎症小体的组装，介导大量IL-18、IL-1β 的释放[3-5]。NAFLD 上调肝脏中NLRP3，进而诱导IL-18、IL-1β 的增加[6]，这一过程是单纯脂肪肝进展到NASH 及肝纤维化的关键因素之一[7]。本研究旨在探讨NAFLD 模型大鼠小肠、肝脏中NLRP3 及相关炎症因子表达情况。

1 材料与仪器

1.1 动物 SD 雄性大鼠（180～220 g）20 只［购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK（湘）2016－0002，实验单位使用许可证编号：SYXK（滇）K2013－0002］。

1.2 试剂 高脂饲料（82.5%普通饲料、10%猪油、2%胆固醇、0.5%胆酸钠、5%蛋黄粉）[8]。普通饲料由楚商生物有限公司提供。

ALT、AST、IL-18、IL-1β、脂多糖ELISA 试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，MM-0047R）。TC、TG生化试剂盒（南京建成，20190824）。Ultrapure RNA Kit RNA 提取试剂盒（康为世纪，CW0581S）；HiFiScript cDNA Synthesis Kit（康为世纪，CW2569M）；UltraSYBR Mixture（康为世纪，CW0957M）。NLRP3 抗体（abcam，ab214185）、SP 免疫组化试剂盒（中杉金桥科技公司，2004C1009）、DAB 显色试剂盒（中杉金桥科技公司，2024G0331）。

1.3 仪器 垂直板电泳装置（TanonVE－180P RE）、垂直板电泳胶转膜仪装置（Tanon VE－586）、荧光定量PCR 仪（Heal Force，CG）、石蜡切片机（Thermo，Finesse 325）、显微镜（奥林巴斯，CX23）。

2 方法

2.1 动物分组及取材 将20 只SD 雄性大鼠随机分为2 组，即正常组、高脂饮食组，每组各10 只。正常对照组给予普通饲料，高脂饮食组给予高脂饲料。4 周末每组取2 只验模，8 周末处死动物，收集血清、肝脏及小肠样本。肝大叶置于4%多聚甲醛固定，室温保存。其余肝脏和小肠分装一份置于RNA保存液中，其余分装后-80℃保存。血清样本分装后-80℃保存。

2.2 血清肝功能变化 血清4℃解冻，根据试剂盒说明书检测大鼠血清ALT、AST、TC、TG 水平。

2.3 肝脏组织病理切片 取4%多聚甲醛固定的肝大叶，常规操作制备肝组织石蜡切片，HE 染色后显微镜下（10×40 倍）拍摄病理图片。

2.4 ELISA 试剂盒检测大鼠血清、肝脏炎性因子按试剂盒说明书操作，检测血清、肝组织中的IL-18、IL-1β。

2.5 RT-PCR 法检测大鼠肝脏、小肠组织中NLRP3mRNA 表达量 按试剂盒步骤提取RNA，测定浓度和纯度。利用Primer3 软件设计引物序列，由华大基因合成，以RT-PCR 方法检测NLRP3mRNA 水平。

2.6 免疫组化法检测大鼠肝脏、小肠组织中NLRP3蛋白表达水平 肝脏切片进行常规脱蜡复水、抗原修复、过氧化物酶结合、抗原封闭。NLRP3 一抗4℃孵育过夜，37℃复温30 min，PBS 冲洗，滴加二抗，37℃孵育20 min，PBS 冲洗。DAB 显色5 min，PBS 冲洗，苏木精复染5 min，盐酸酒精分化1～3 s，自来水冲洗10 min，常规脱水，透明，封片，镜检。

2.7 统计学分析 通过SPSS20.0 软件进行处理，计量资料以（±s）表示，组间比较采用独立样本t 检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。免疫组化结果使用Image-Pro Plus 6.0 软件进行阳性率统计。

2.8 伦理学审查 本研究方案经由云南中医药大学实验动物伦理委员会审批（批号：R－06201947），符合实验室动物管理与使用准则。

3 结果

3.1 肝组织病理学变化

3.1.1 肝脏形态观察 正常组大鼠肝脏呈暗红色，表面光滑，边缘锐利，体积较小。模型组大鼠肝脏颜色明显偏黄，表面有脂肪粒凸起，有油腻感，体积较大。如图1。

图1 肝脏形态

3.1.2 HE 染色 正常组大鼠肝组织肝索清晰，肝细胞形态规则，沿肝索有序排列，细胞核边缘清晰，胞质未见明显脂肪空泡及炎性病变。高脂饮食组大鼠肝细胞排列紊乱，可见明显的肝细胞气球样变，细胞大小不一，出现大量脂肪空泡，部分细胞核边缘模糊或不可见。如图2。

图2 肝组织病理切片（HE 染色病理切片，×400）

3.1.3 油红O 染色 正常组肝组织基本无橘红色脂滴，细胞核清晰。模型组大鼠可见大量圆形脂肪空泡，以及大面积橘红色脂滴，细胞核边缘多不清晰，细胞形态不规则，与正常组相比，出现明显的脂肪变性。如图3。

3.2 生化指标 检测结果显示，模型组大鼠血清肝功能指标ALT、AST 显著高于正常组（P＜0.05），提示模型组大鼠存在肝脏细胞受损情况。此外，模型组大鼠肝脏中TC、TG 显著高于正常组（P＜0.05），血清中TG 显著升高（P＜0.05），TC 有上升趋势，但与正常组无显著差异（P＞0.05）。如表1。

表1 大鼠生化指标比较（±s）

注：与正常组相比，▲P＜0.05。

ALT AST TC TG组别 n 血清/（mmol·L-1）正常组 8 15.78±1.93 15.72±1.32 47.08±4.32 47.29±2.6 0.58±0.20 0.67±0.18 7.82±2.49 1.11±0.26模型组 8 21.55±2.02▲ 21.99±1.09▲ 67.1±5.37▲ 69.8±4.27▲ 0.94±0.20▲ 0.91±0.13 10.35±1.93▲ 1.33±0.46▲F 值 0.19 0.25 0.67 1.21 0.80 0.51 0.24 1.24肝脏/（ng·L-1）血清/（ng·L-1）肝脏/（ng·L-1）血清/（ng·L-1）肝脏/（mmol·gprot-1）血清/（mmol·L-1）肝脏/（mmol·gprot-1）P 值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05

3.2.1 肝脏、血液中炎症因子 ELISA 试剂盒检测结果显示，与正常组相比，模型组肝脏中IL-1β、IL-18显著升高（P＜0.05），血清中IL-1β 显著升高（P＜0.05）。如表2。

表2 大鼠炎症因子表达量比较（±s，ng·L-1）

注：与正常组相比，▲P＜0.05。

组别 n IL-1β IL-18肝脏 血清 肝脏 血清正常组 8 37.77±1.82 45.28±9.65 164.23±35.55 106.72±16.64模型组 8 43.31±1.71▲ 65.2±17.19▲ 196.13±35.63 139.76±11.07▲F 值 0.116 1.556 0.218 1.437 P 值 ＜0.05 ＜0.05 ＞0.05 ＜0.05

3.2.2 RT-PCR 检测肝脏、小肠中NLRP3mRNA 表达量 RT-PCR 结果表明，模型组大鼠肝脏、小肠NLRP3mRNA 表达量显著升高（P＜0.05）。如表3。

表3 大鼠NLRP3mRNA 表达量（±s）

表3 大鼠NLRP3mRNA 表达量（±s）

注：与正常组相比，▲P＜0.05。

组别 n NLRP3mRNA肝脏 小肠正常组 3 0.01±0.004 0.002±0.001模型组 3 0.031±0.001▲ 0.221±0.109▲F 值 4 15.659 P 值 ＜0.05 ＜0.05

3.2.3 免疫组化法检测肝脏、小肠中NLRP3 表达量与正常组相比，模型组大鼠肝脏、小肠NLRP3 表达量显著升高，且P＜0.05，如表4。从免疫组化图片中可以看出，模型组大鼠较正常组大鼠的棕色区域更多，即NLRP3 阳性表达更高，如图4。

图4 NLRP3 表达量（免疫组化染色，×400）

表4 大鼠NLRP3 阳性率（±s）

表4 大鼠NLRP3 阳性率（±s）

注：与正常组相比，▲P＜0.05。

组别 n NLRP3 阳性率/%肝脏 小肠正常组 3 0.0065±0.004 0.0037±0.005模型组 3 0.0402±0.0133▲ 0.0349±0.0121▲F 值 3.284 7.454 P 值 ＜0.05 ＜0.05

4 讨论

孙林林等[8]对高脂模型进行改良，添加胆酸钠及蛋黄粉增加肝脏对胆固醇的吸收，加快了成模速度，该改良模型8 周出现炎性反应，12 周则形成明显的肝脏纤维化。本实验证实该模型成模较快，比普通高脂模型有更好的炎性反应。

“肠-肝轴”在1988 年由Marshall 提出[9]，其认为肠道与肝脏由于门静脉的连接和相同的胚胎起源，二者在生理病理方面相互影响[10]。肝肠之间可通过门静脉进行物质交换，而肠道菌群及其它物理化学因素的改变，可能造成肠道屏障损伤，肠内有害物质（如LPS）进入门静脉，激活小肠和肝脏固有免疫，上调炎症因子，进一步加重了肝内炎症和代谢紊乱[11]。课题组对NAFLD 肝、肠NLRP3 和相关炎症因子变化进行探讨，发现NAFLD 大鼠中小肠、肝脏中NLRP3 表达显著升高，肝脏、血清中炎症因子IL-1β、IL-18 显著上升。NAFLD 不仅能够激活肠道的固有免疫，且能通过门静脉引起肝脏免疫反应的激活，并进一步增加炎症因子的释放。

有研究认为高脂饮食改变肠道菌群，诱发肠道炎症，肠道屏障功能减弱后，LPS 可从肠道入血，并经门静脉进入肝脏，激活Toll 样受体4（TLR4），使肝NLRP3 炎症小体活化，随后IL-18、IL-1β 释放增加，肝脏炎症反应加剧[12-14]。

NLRP3 炎症小体的激活途径多样，微生物、胆汁酸等其它因素是否参与NAFLD 模型大鼠小肠、肝脏内NLRP3 的调节尚待进一步研究。