M1型和M2型巨噬细胞及相关组织因子在结核性胸膜炎患者治疗前后的变化及意义

朱锦琪 陈剑波 杨红忠 高欣

结核性胸膜炎(Tuberculous pleurisy effusion, TP)是临床上最常见的肺外结核类型，研究表明TP患者会发生胸膜粘连及肥厚，而后者可引起限制性肺功能下降，严重影响患者的生活质量[1]。巨噬细胞作为固有免疫系统中具主要功能执行细胞，在TP发生发展过程中发挥着重要的作用[2]。研究报道巨噬细胞在不同的环境下分化为具有不同功能的亚型，其中M1型巨噬细胞主要发挥促进细胞免疫的作用，而M2型巨噬细胞主要负向调控免疫反应[3,4]。但目前尚鲜有巨噬细胞分化与TP的相关报道，本研究旨在探究不同极化状态的巨噬细胞及其相关组织因子在TP患者中的表达和治疗对其的影响及意义,以期为临床靶向调控M1/M2巨噬细胞分化的治疗及药物研发，提供实验室基础及理论依据。

对象和方法

一、研究对象

1 一般情况 选取自2018年01月至2018年12月在我院住院治疗，诊断为结核性胸膜炎的患者38例，男性21例，女性17例，平均年龄(38.2±6.9)岁。另选取同期来我院体检中心体检的志愿者20 例作为健康对照组，其中男性13例，女性7例，平均年龄(35.6±4.7)岁。两组受试者的性别、年龄差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究的全部受试者均签署知情同意书。

2 入组标准 (1)符合中华医学会指定的《临床诊疗指南结核病分册》中结核性胸膜炎的诊断标准且诊断为 TP 的患者；(2)能取得胸腔积液进行检测者；(3)既往无结核病治疗史；(4)同意入组的患者。

3 排除标准 (1)合并 HIV 感染及胸腔细菌感染者；(2)孕妇及年龄<16岁或>80岁；(3)入院及出院1月后复查未取得胸腔积液者；(4)合并肿瘤、自身免疫性疾病、肝炎或其他系统性疾病的患者；(5)正在进行抗凝或抗血小板治疗的患者；(6)不能耐受抗TP治疗者；(7)拒绝参加本研究的患者。

二、方法

1 主要试剂与仪器 组织因子测定的ELISA试剂盒均购自武汉博士德生物公司；RPMI 1640与PBS缓冲液购自美国Hyclone公司；胎牛血清(FBS)购自杭州四季青生物公司；小鼠抗人F4/80-APC mAb、CD206-PE/Cy5.5 mAb、CD86-FITC mAb均购自美国Biolegend公司；淋巴细胞分离液(Ficoll)购自美国Thermo公司；FACS Arial Ⅱ流式细胞仪购自美国BD Bioscience公司。

2 标本采集 入选的TP患者在入院接受抗结核治疗前及常规结核性胸膜炎治疗1月后抽取外周血20 mL及胸腔积液10 mL；健康对照组抽取外周血20 mL。所有外周血均于晨起空腹抽取并用肝素进行抗凝。

3 标本检测 所有受试者的外周血平均分为2份，一份用于检测外周血单个核细胞(PBMC)中巨噬细胞M1、M2比例，另外一份用于检测IL-10、 IL-12、组织型纤溶酶原激活物(t-PA)、纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)的表达水平；胸腔积液同样平均分为2份，分别进行检测胸腔积液单个核细胞(PFMC)中巨噬细胞M1、M2所占比例及IL-10、 IL-12、 t-PA、 PAI-1、腺苷脱氢酶(ADA)、乳酸脱氢酶(LDH)、蛋白的表达水平。

4 细胞因子及生化指标的检测 采用酶联免疫吸附实验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay , ELISA)测定胸腔积液与外周血中IL-10、 IL-12、 t-PA、 PAI-1的含量；其他检测如胸腔积液中ADA、 LDH、蛋白等均在本院检验科进行测定。

5 外周血与胸腔积液中单个核细胞(PBMC/PFMC)的分离 采用Ficoll密度梯度离心法分离所有受试者外周血及TP患者胸腔积液中的PBMC/PFMC，方法简述如下：将收集血液标本及TP患者的胸腔积液标本置于离心机中，常温下1 500 r/min离心10 min，取下层细胞沉淀与等体积的PBS混匀后缓慢匀速加至适量的Ficoll液面上，并使其形成界面。将上述得到的分层液体于室温下在缓升缓降的离心机中2 320 r/min离心20 min, 使其分层，移液管小心吸出中间形成的“云雾层”细胞，并加入5倍体积的PBS，室温下1 500 r/min离心10 min，底层沉淀即为分离所需的PBMC/PFMC，PBS洗涤细胞2次进行纯化，并置于细胞冻存液中于液氮中进行保存，以备后续实验使用。

6 流式细胞术检测巨噬细胞中M1与M2比例 常规复苏PBMC/PFMC后，用含10% FBS的RPMI 1640于37 ℃、5% CO2培养箱内进行培养30 min后取出，并调整细胞密度至1×105个/mL，取2mL至流式管中，800 r/min离心5 min，弃上清后，加入100 μl的PBS重悬细胞，依次加入F4/80-APC、CD206-PE/Cy5.5、CD86-FITC,于4 ℃避光孵育30 min后，加入2 mL PBS洗涤细胞，800 r/min离心10min ,弃上清，再加入0.2 mL PBS重悬细胞，0.22 μm滤膜过滤后上机进行检测分析。其中M1巨噬细胞的特征性表面分子标记物为F4/80+CD86+，M2细胞为F4/80+CD206+。

三、统计学处理

所有数据采用 SPSS 20.0软件进行统计分析。所有数据在分析前均进行正态性检验，符合正态分布且方差齐的两独立样本的均数之间比较，采用两独立样本t检验；偏态分布的两独立样本的均数之间比较，采用秩转换的非参数检验；同一组治疗前后的计量资料分析，采用重复测量数据的单因素方差分析；两变量间的线性相关分析，若数据服从双变量正态分布且方差齐，采用Pearson线性相关分析；若不服从上述条件，则采用Spearman相关。以P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、FCM检测外周血PBMC与胸腔积液PFMC中M1、M2巨噬细胞的表达情况

流式细胞术检测两组患者PBMC与PFMC中F4/80+CD86+M1巨噬细胞与F4/80+CD206+M2巨噬细胞所占比例，结果显示在PBMC中，治疗前TP组的M2型巨噬细胞(37.405±10.652)较对照组(12.1337±8.533)显著升高(P<0.01)，而治疗前TP组中的M1型巨噬细胞(8.407±3.189)较对照组(9.023±6.542)无明显变化(P>0.05)；在治疗前TP组PFMC中M2型巨噬细胞(68.594±30.177)所占比例较M1型巨噬细胞(22.436±16.329)明显升高(P<0.01)(见图1)。TP患者经1个月规律抗TP治疗后，FCM检测外周血PBMC及胸腔积液PFMC中M1、M2巨噬细胞所占比例，结果显示与TP组治疗前相比，PBMC中M2型巨噬细胞(22.354±11.371)显著下降(P<0.01)，而M1型巨噬细胞(10.063±4.855)明显降低(P<0.05)；在PFMC中，TP组与治疗前相比，M2型巨噬细胞(55.178±20.661)显著下降(P<0.01)，而M1型巨噬细胞(11.304±5.722)亦明显减少(P<0.05)(见图2)。

图1 流式细胞术检测两组患者M1、M2巨噬细胞的比例

图2 流式细胞术检测TP患者抗TP治疗后M1、M2巨噬细胞的比例

二、血清中与胸腔积液中各项检测指标的分析

ELISA检测TP组与健康对照组外周血中IL-10、 IL-12、 t-PA、 PAI-1的水平，结果显示与健康对照组相比，TP组治疗前外周血中IL-10、PAI-1的表达水平显著升高(P<0.01)，而t-PA却明显降低(P<0.01)，IL-12无明显变化(P>0.05)；在治疗前TP组中，胸腔积液中IL-10、 IL-12、 t-PA、 PAI-1的表达水平均较外周血中显著升高，差异均具有统计学意义(P<0.01)；TP组治疗后，外周血中IL-10、PAI-1较治疗前相比，表达水平显著降低(P<0.05)，胸腔积液中，IL-10、PAI-1、ADA、LDH较治疗前显著降低(P<0.05)，而t-PA较治疗前明显升高(P<0.01)，其他检测指标均无明显变化(P>0.05)(见表1)。

表1 外周血中与胸腔积液中各项检测指标的分析

三、TP患者M1、M2型巨噬细胞与各项检测指标之间的关系

治疗前，TP患者外周血中：M1型巨噬细胞与IL-10、 IL-12、 t-PA、 PAI-1无明显相关性(P>0.05)；M2型巨噬细胞与 IL-10、 PAI-1呈正相关(P<0.05)，与IL-12、 t-PA无明显相关性(P>0.05)。在TP患者胸腔积液中：M1型巨噬细胞与IL-12呈正相关(P<0.05)，与IL-10、t-PA、 PAI-1、LDH、ADA、蛋白无明显相关性(P>0.05)；M2型巨噬细胞与IL-10、PAI-1、LDH、ADA呈正相关(P<0.05)，与t-PA呈明显负相关，与IL-12、蛋白无明显相关性P>0.05)(见表2、3)。

表2 外周血中M1、M2型巨噬细胞与各项检测指标的相关性

表3 胸腔积液中M1、M2型巨噬细胞与各项检测指标的相关性

讨 论

TP是最常见的肺外结核类型，常见的并发症为胸膜黏连增厚，胸腔积液等，若病情迁延恶化将出胸廓塌陷、脓胸、支气管胸膜瘘等严重并发症，直接影响患者的生活质量及预后[3, 5]。

巨噬细胞作为结核感染的第一道防线，其在结核分支杆菌的的刺激下可产生IL-1α，LI-12等一系列细胞因子以促进巨噬细胞本身抗原递呈功能的上调和T细胞的激活，而激活的T细胞能够分泌IFN-γ、TNF等促炎因子，进一步诱导巨噬细胞的活化[6，7]。成熟活化的巨噬细胞具有M1、M2两种功能形态，前者主要促进炎症反应，募集、活化多种促炎因子，如IL-1、IL-12、TNF-α等，流式细胞术可检测CD86为其表面特征性表达蛋白，而M2型巨噬细胞主要缓解炎症反应，合成及分泌抗炎因子IL-10、TNF-β等以促进组织修复与重塑，常见的M2型表面标志有CD163、CD206等[4]。

近年来，有多数学者报道在结核病中出现巨噬细胞极化现象，如Huang等[8]报道在肺结核患者体内，高表达的IL-37能够通过诱导巨噬细胞向M2型分化并促进后者对抗炎因子IL-10、TGF-β、INF-γ的分泌从而促进疾病的发生、发展。Bénard A等[9]在对结核分枝杆菌感染的小鼠模型的研究中发现，结核分枝杆菌可直接刺激小鼠体内的B细胞使其通过分泌Ⅰ型IFN调节骨髓中的巨噬细胞向抑制炎症反应的M2型巨噬细胞进行分化。在本研究中通过流式细胞术对比健康人群与结核性胸膜炎患者的外周血发现，TP患者PBMC中M2型巨噬细胞占主导地位且其表达率显著高于健康人群，而M1型巨噬细胞在两组人群中尚无发现明显变化。在TP患者的PFMC中同样证实，M2型巨噬细胞的表达率明显高于M1型巨噬细胞。在经过1个月的规律抗TP治疗后，流式细胞术再次检测TP患者PBMC与PFMC的M1、M2型巨噬细胞变化，结果显示治疗后TP患者的M1、M2细胞表达均呈现降低趋势，其中以M2型巨噬细胞比例减少最为显著。这提示在TP患者体内同样存在M1/M2表达失衡的现象，而抗结核治疗可对其进行部分改善。纤溶功能与胸膜的纤维化形成密切相关，纤溶活性的下降可导致纤维蛋白在脏层与壁层胸膜的沉积黏连[10]。组织型纤溶酶原激活物(t-PA)与纤溶酶原激活物抑制因子-1(PAI-1)是机体中重要的一对纤溶因子，其通过在血液与胸腔内形成t-PA/ PAI-1复合物使前者失活，降低血液中或组织内的纤溶活性，减少纤维蛋白的溶解现象[11， 12]。而腺苷脱氢酶(ADA)与乳酸脱氢酶(LDH)作为胸腔积液检测胸腔积液性质具有重要的参考价值。有研究表明在结核病高发地区，检测ADA是诊断胸膜结核的首选筛查方法，且其对诊断TP的敏感性及特异度均可达90%以上[13，14]。有文献报道胸腔积液中LDH≥1000 IU/L多提示胸膜炎症反应较重，故LDH也是反应胸膜黏连增厚的重要指标之一[14]。

为进一步明确上述组织因子是否与TP患者体内M1/M2极化现象具有相关性，我们又通过ELISA检测外周血与胸腔积液中的组织因子IL-10、IL-12、t-PA、PAI-1与ADA、LDH、蛋白的表达，相关性分析结果显示，TP患者外周血中M2型巨噬细胞与IL-10、PAI-1呈正相关，在胸腔积液中M1型巨噬细胞与IL-12呈正相关，M2型巨噬细胞与IL-10、PAI-1、ADA、LDH呈正相关，与t-PA呈明显负相关。且与健康人群相比，TP患者外周血中IL-10、PAI-1的表达显著增加，而t-PA明显降低，经1个月的规律治疗后，TP患者外周血中及胸腔积液中IL-10、PAI-1明显降低，t-PA明显升高，胸腔积液中的ADA、LDH、蛋白同样较治疗前明显降低，这提示经规律治疗后TP患者外周血中及胸腔积液中的组织因子较前部分恢复。

综上所述，本研究结果显示，在结核性胸膜炎中存在M1/M2极化现象，其中以M2巨噬细胞占主导地位，且外周血与胸腔积液中IL-10、PAI-1、t-PA与ADA、LDH水平与M2型巨噬细胞具有一定的相关性，而抗结核治疗可明显改善M1/M2表达失衡及组织因子过度表达的现象。然而，上述作用机制可能仅仅是一个方面，有关巨噬细胞在结核性胸膜炎中的其他作用，尚需进一步研究探讨。