滑膜组织中MMP-13与β-catenin对于骨关节炎严重程度的评估价值

朱志勇，吴开元，汪海军，袁永端，张 伟，朱 凡

骨关节炎(osteoarthritis, OA)是一种退行性骨关节病，主要特点为骨赘形成、关节软骨破坏[1]，在中老年人中患病率较高。研究表明，在我国年龄超过40岁的群体中，OA患病率高达28.7%，其中女性32.8%，男性23.5%[2]。OA发病机制比较复杂，主要与年龄、创伤、遗传、过度负重、肥胖等因素存在关联[3]。基质金属蛋白酶13(MMP-13)属于MMPs家族的重要成员，参与软骨细胞外基质的分解、代谢过程，并且能对Ⅱ型胶原进行水解，导致软骨发生磨损病变[4]。此外，有研究发现β-catenin信号通路对软骨细胞增殖、分化、凋亡有调节作用，且对软骨基质分解、代谢存在较大影响[5]。由此可见，MMP-13、β-catenin可能与OA发病有关。本研究旨在分析滑膜组织中MMP-13、β-catenin在OA严重程度中的评估价值，为临床诊疗提供依据。

1 对象与方法

1.1 对象 选取我院2017-04至2019-04收治的OA患者92例，根据疾病严重程度将其分成轻度组(n=47)、中/重度组(n=45)。轻度组男25例，女22例，年龄38～76岁，平均(58.91±9.71)岁；体质指数(18～24) kg/m2，平均(21.08±1.25)kg/m2；病程3～13个月，平均(8.63±3.25)月。中/重度组男22例，女23例，年龄35～78岁，平均(59.24±8.82)岁；体质指数(18～24)kg/m2，平均(21.14±1.16)kg/m2；病程3～12个月，平均(8.26±3.11)月。本研究方案获得伦理委员会批准，两组基线资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准 (1)符合中华医学会骨科学分会[6]制定的《骨关节炎诊治指南(2007年版)》中关于OA的诊断标准，经X线、CT等检查结合临床表现证实；(2)关节液黏稠、清亮；(3)晨僵时间≤30 min；(4)活动时存在骨擦感；(5)患者签署知情同意书。

1.2.2 排除标准 (1)恶性肿瘤；(2)入院前有骨关节手术史；(3)入院前3个月内有抗炎治疗史；(4)未能获得滑膜组织标本。

1.3 方法 利用免疫组化法测定所有患者滑膜组织中MMP-13、β-catenin的阳性、阴性表达情况。患者入院后行关节置换术，并取滑膜组织送检。经多聚甲醛溶液(浓度为4%)固定24 h，然后行免疫组化检测。

1.3.1 HE染色 (1)取材固定，石蜡包埋，切片，厚度为4 μm；(2)脱蜡至水；(3)经苏木精进行复染，时间为5 min，经自来水予以冲洗；(4)采用盐酸乙醇分化，时间为30 s；(5)经50 ℃温水浸泡5 min；(6)置于伊红液内反应2 min；(7)脱水、透明，经中性树脂封片。

1.3.2 免疫组化染色 (1)石蜡切片，在60 ℃环境下烘烤1 h；(2)脱蜡至水；(3)浸泡于过氧化氢(3 g/L)内，经蒸馏水进行3次水洗；(4)经复合消化液予以处理，时间为5 min，经蒸馏水进行3次水洗；(5)羊正常血清封闭20 min，将多余液体去除，无需清洗；(6)加入一抗，在4 ℃环境下孵育18 h，经PBS缓冲液进行3次冲洗，2 min/次；(7)经生物素化羊抗兔IgG进行孵育，时间为20 min，经PBS缓冲液进行3次冲洗，2 min/次；(8)经链卵白素工作液(辣根过氧化物酶标记)孵育20 min，经PBS缓冲液进行4次冲洗，5 min/次；(9)行DAB染色，流水即可终止；(10)经苏木精进行复染，脱水、透明，经中性树胶予以封片。

1.3.3 采用反转录检测法测定MMP-13、β-catenin在滑膜组织中的表达量 (1)将提前冻存的组织标本取出，剪碎后置于Trizol(1ml)内，充分均浆；(2)以1 ml∶200 μl比例将氯仿溶液加入Trizol内，充分混匀，在室温下反应5 min；(3)在4 ℃条件下离心15 min(13000 r/min)；(4)取冰异丙醇加入上清液，在-20 ℃冰箱内反应1 h，在4 ℃条件下离心10 min(13000 r/min)，弃上清液，使RNA于管底沉淀；(5)取乙醇(浓度为75%)1 ml对RNA沉淀进行清洗，振荡并悬浮沉淀；(6)在4 ℃条件下离心5 min(7500 r/min)，弃上清液，经移液器将残留上清液吸除，在室温下反应5～10 min；(7)取去离子水20 μl加入，将RNA溶解；(8)将部分RNA稀释，对其浓度、纯度予以计算，存放于-80 ℃冰箱内。经GeneRunner软件对引物进行设计，PCR反应条件如下：95 ℃预变性 5 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min。绘制受试者工作特征曲线(ROC)分析MMP-13、β-catenin表达量对OA严重程度的预测价值。

1.4 评价标准 (1)阴性、阳性判定：取10个高倍镜视野(×400)进行观察，阳性细胞数≤10%为阴性，阳性细胞数11%～25%为弱阳性，阳性细胞数26%～50%为阳性，阳性细胞数超过50%为强阳性。(2)OA严重度评估：参考《骨关节炎诊治指南(2007年版)》[6]评估，无异常为0级；关节内有可疑骨赘，关节间隙未见异常为Ⅰ级；关节内肯定有骨赘形成，且关节间隙疑似狭窄为Ⅱ级；关节内存在少量骨赘，伴囊性、硬化病变，关节间隙狭窄为Ⅲ级；关节内存在多发骨赘形成，伴囊性、硬化病变，关节间隙消失或重度狭窄为Ⅳ级。其中Ⅰ级属于轻度病变，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级为中/重度病变。

2 结 果

2.1 MMP-13、β-catenin的阳性表达比较 轻度组的MMP-13、β-catenin阳性率分别为68.09%(32/47)、55.32%(26/47)，显著低于中/重度组的88.89%(40/45)、75.56%(34/45)，差异均有统计学意义(χ2=5.848，P=0.016；χ2=4.150，P=0.042)。

2.2 MMP-13、β-catenin的表达量比较 轻度组MMP-13(0.69±0.24)、β-catenin(0.95±0.37)的表达量均低于中/重度组(1.02±0.31，2.16±1.12)，差异均有统计学意义(t=5.724，P<0.001；t=7.019，P<0.001)。

2.3 MMP-13、β-catenin表达量对OA严重度的预测价值分析 MMP-13、β-catenin表达量预测OA严重度的曲线下面积分别为0.656、0.683。以MMP-13>0.887、β-catenin>1.975时，病情发展为中/重度的风险越高(表1)。ROC曲线见图1、2。

表1 MMP-13、β-catenin表达量对OA严重度的预测价值分析

图1 MMP-13表达量预测OA严重度的ROC曲线

图2 β-catenin表达量预测OA严重度的ROC曲线

3 讨 论

OA具有症状反复、病程长等特点，这类患者通常需长期接受治疗，且要对其病情进行动态观察，提高治疗针对性。现阶段，各类检查方法均不适用于OA的动态观察，导致患者病情难以及时进行准确评估，影响治疗方案的制定。本研究针对OA患者进行MMP-13与β-catenin检测，分析二者在滑膜组织中的变化情况，便于评价患者的疾病严重度。

本研究结果提示，轻度组的MMP-13、β-catenin阳性率显著低于中/重度组，且二者阴性率高于中/重度组，表明随着OA病情越重，患者的MMP-13、β-catenin阳性率越高，阴性率越低。有研究指出MMPs等蛋白酶可导致关节软骨破坏，从而引起OA病变[7]。MMPs可对软骨细胞外基质进行降解，并将其他MMPs激活，产生瀑布效应，促进OA进展[8]。MMPs含5类酶系，其中明胶酶、基质降解素、胶原酶是3类比较重要的酶系，而最早发现的酶系为胶原酶，包括MMP-13、MMP-8及MMP-1，以MMP-13最具活性[9]。研究表明MMP-13可将IX型胶原降解，而IX型胶原对维持软骨稳定性而言至关重要，一旦其被降解，则会削弱软骨稳定性，从而引起软骨损害，这可能是MMP-13引起OA病变的重要机制[10]。β-catenin已被证实能调节人体骨骼、软骨发育，其信号通路在成年人中呈低表达[11]。而OA病变可激活β-catenin信号通路，从而对软骨细胞分化、成熟有促进作用，可使蛋白酶活性增强[12]。因此，β-catenin信号通路异常会加重OA病变程度。

本研究发现，轻度组MMP-13、β-catenin的表达量均低于中/重度组，且经ROC曲线证实二者对OA严重度具有预测价值。研究发现，在OA患者的软骨降解过程中有炎性反应参与，如肿瘤坏死因子α、IL-1β等均参与了这一过程，且这些因子能使OA软骨内MMPs表达上调[13]。这为本研究提供了理论支持，本研究主要针对MMP-13进行探讨，它是软骨基质降解过程中的主要蛋白酶，可体现Ⅱ型胶原代谢情况。研究表明IL-6参与了MMPs对机体的调控过程，它结合于自身可溶性受体后，能使软骨细胞MMP-13表达增强，导致软骨基质退变，但具体机制尚未明确[14]。因此，笔者推测随着OA越严重，患者的炎性反应越重，IL-6水平越高，从而进一步对软骨细胞中MMP-13表达进行调节，导致其上调。β-catenin信号在正常机体中对软骨细胞凋亡有抑制作用，可促进其成熟，然而，一旦其表达过度，则会导致成熟加速，并上调蛋白酶表达量，促进软骨基质降解，致关节软骨破损[15]。这表明β-catenin信号过表达会为软骨基质降解提供条件，加重OA病情进展。

总之，OA患者病情越重，MMP-13与β-catenin阳性率越高，且二者在滑膜组织中的表达量越高，MMP-13、β-catenin在滑膜组织中的表达量对OA严重度具有预测价值。本研究选取92例，样本量少，未来将扩大样本量进一步探讨。